張雅麗 劉理想 孫大明 劉軍花

(國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物研究室，南京210095)

瘤胃作為反芻動(dòng)物特有的消化吸收器官，其發(fā)育狀態(tài)直接影響反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康。而新生反芻動(dòng)物瘤胃功能發(fā)育尚不完善，不能夠充分地消化和吸收固體飼料[1]，所以在生產(chǎn)中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)手段促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育和成熟對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和維持動(dòng)物健康具有重要意義。瘤胃的發(fā)育成熟包括瘤胃微生物區(qū)系的建立健全及瘤胃上皮形態(tài)和功能的完善；瘤胃微生物區(qū)系的建立健全主要是保證高效消化植物性固體飼料產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及菌體蛋白；瘤胃上皮功能的完善主要是保證高效吸收和代謝VFA，維持瘤胃穩(wěn)態(tài)并為機(jī)體供能[2]。瘤胃上皮發(fā)育與細(xì)胞周期的變化密切相關(guān)。細(xì)胞周期包括靜止期(G0期)、分裂間期(G1期、S期和G2期)和分裂期(M期)。其中，G1期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)DⅠ和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4的mRNA的大量表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期快速進(jìn)入S期[3-4]，在S期急速合成與DNA復(fù)制相關(guān)的酶類[5-6]。

近期研究表明，口腔灌服0.36 g/kg BW的丁酸鈉可促進(jìn)哺乳期羔羊瘤胃乳頭的生長(zhǎng)，并且該過(guò)程與瘤胃上皮細(xì)胞增殖的加速和細(xì)胞凋亡的抑制相關(guān)[7-8]，表明灌服適宜劑量丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮的發(fā)育有促進(jìn)作用[9]，但是灌服不同劑量丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的促進(jìn)作用及機(jī)制需進(jìn)一步探明。研究證實(shí)，瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物丁酸在體內(nèi)條件下能夠促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育，但單獨(dú)在體外試驗(yàn)中卻沒(méi)有發(fā)揮作用[8]，上述研究提示，丁酸促進(jìn)瘤胃上皮發(fā)育并非直接作用，可能與某些激素調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)[9]。同時(shí)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的胎牛血清有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，這可能是胎牛血清中的胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的成纖維細(xì)胞CyclinDⅠ表達(dá)和Cyclin-CDK4復(fù)合物合成，進(jìn)而加快細(xì)胞增殖，于是采用無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，單獨(dú)添加適量的IGF-Ⅰ后，2 d內(nèi)細(xì)胞增殖明顯加快，合成的DNA量也明顯增多[10]。

在單胃哺乳動(dòng)物中，IGF-Ⅰ可以通過(guò)自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)多種組織的細(xì)胞增殖和凋亡，IGF-Ⅰ和胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ受體(IGF-ⅠR)結(jié)合后可以激活下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將相關(guān)細(xì)胞信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[11-13]。而在新生反芻動(dòng)物上尚未有相關(guān)報(bào)道?，F(xiàn)有研究表明，灌服丁酸鈉促進(jìn)反芻動(dòng)物瘤胃上皮細(xì)胞增殖與IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和瘤胃上皮增殖因子密切相關(guān)[14-17]。因此，本文通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)，研究不同濃度丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞凋亡的影響，再進(jìn)一步探究丁酸鈉通過(guò)IGF-Ⅰ信號(hào)通路調(diào)控瘤胃上皮細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為生產(chǎn)中通過(guò)營(yíng)養(yǎng)手段促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)育和成熟、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和維持動(dòng)物健康提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤胃上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

試驗(yàn)選擇4只49日齡，性別一致，體重分別為11.3、12.9、11.2和11.0 kg的湖羊公羔羊用于細(xì)胞試驗(yàn)。羔羊瘤胃上皮細(xì)胞的分離及培養(yǎng)參照Stumpff等[18]和盧勁曄[19]的方法進(jìn)行了改進(jìn)。具體操作步驟如下：

1)羔羊屠宰后立即分離瘤胃，用6倍的青鏈霉素的D-Hanks溶液多次沖洗，去除瘤胃內(nèi)容物，然后再漂洗2～3次，能有效地去除殘留的細(xì)菌和真菌。

2)在D-Hanks溶液中小心地用分離工具如剪刀、鑷子、手術(shù)刀等鈍性分離黏附的漿膜和肌肉，收集瘤胃腹囊部上皮組織塊，然后再用D-Hanks溶液沖洗3次。

3)將瘤胃組織剪成小塊平鋪在錐形瓶底部，加入含0.25%的胰蛋白酶液(Gibco公司，美國(guó))在37 ℃水浴中消化30 min，消化液沒(méi)過(guò)組織即可，每隔5 min輕輕搖晃，使其消化均勻。

4)重復(fù)上述胰蛋白酶消化步驟3次；若中途胰蛋白酶溶液出現(xiàn)渾濁，可進(jìn)行更換；等到瘤胃上皮組織出現(xiàn)黏稠且乳頭發(fā)白，一般羊的瘤胃上皮組織的消化時(shí)間為2～3 h。

5)進(jìn)入超凈臺(tái)操作，將上述處理后的上皮組織置于無(wú)菌燒杯中，用D-Hanks液清洗3次，更換燒杯再洗3次。

6)清洗后用含0.25%胰蛋白酶繼續(xù)消化，直到看到有細(xì)碎細(xì)胞脫落(大部分是橢圓形細(xì)胞時(shí)開(kāi)始收集)，間隔5 min收集1次細(xì)胞消化液。

7)收集的細(xì)胞消化液用70 μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾(事先在收集的離心管中加入2 mL的血清)后，在1 500 r/min下離心8 min收集細(xì)胞。

8)用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)將收集到的細(xì)胞沉淀清洗2次，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后離心，然后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，接種到培養(yǎng)瓶中(除培養(yǎng)基外還要加入10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

9)培養(yǎng)1 h后，輕輕吸取上層懸液于另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，換瓶培養(yǎng)重復(fù)2次可有效去除成纖維細(xì)胞；換瓶培養(yǎng)48 h后，更換新的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)(瓶底鋪滿明膠的培養(yǎng)瓶)，5 d后細(xì)胞大量貼壁，形態(tài)均一，呈鱗片狀，即綿羊羔羊瘤胃上皮細(xì)胞(圖1)。細(xì)胞貼壁后可進(jìn)行試驗(yàn)處理。

圖1 羔羊瘤胃上皮細(xì)胞消化分離后120 h生長(zhǎng)情況

10)將細(xì)胞凍存，在鋪層至80%～90%時(shí)，PBS清洗2次，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化4 min，終止消化后離心處理，重懸于凍存液[胎牛血清∶杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)=9∶1]，按照凍存步驟儲(chǔ)存于液氮中。

1.2 丁酸鈉和IGF-ⅠR抑制劑溶液配制

丁酸鈉溶液的配制：取1 g丁酸鈉(Sigma公司，美國(guó))溶解于11.35 mL的DMEM中，配制成濃度為800 mmol/L的母液，試驗(yàn)時(shí)再稀釋成所需要的濃度。

IGF-ⅠR抑制劑[鬼臼苦素(picropodophyllin，PPP)]溶液配制：將100 mg的IGF-ⅠR抑制劑(Merck Millipore公司，美國(guó))溶解在100 μL的二甲基亞砜(Sigma公司，美國(guó))中，然后加入9.5 mL的DMEM配制成濃度為2.5×10-4mol/L的母液。參照Duan等[20]研究，試驗(yàn)時(shí)IGF-ⅠR抑制劑需要配制成濃度為2.5 μmol/L的溶液。

1.3 體外細(xì)胞試驗(yàn)設(shè)計(jì)

待細(xì)胞貼壁大約80%后，更換培養(yǎng)基，將胎牛血清的濃度降至0.5%，饑餓12 h，使細(xì)胞同步化。然后將細(xì)胞分為4組，分別添加0、2、4、8 mmol/L丁酸鈉。為了進(jìn)一步研究IGF-Ⅰ信號(hào)通路在添加丁酸鈉促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖中的作用，將細(xì)胞分為3組，丁酸鈉組添加4 mmol/L丁酸鈉，抑制劑組添加4 mmol/L丁酸鈉+2.5 μmol/L IGF-ⅠR抑制劑(在添加丁酸鈉前1 h加入IGF-ⅠR抑制劑)，對(duì)照組加入相同體積的DMEM。所有細(xì)胞試驗(yàn)重復(fù)4次。細(xì)胞處理24 h后收集細(xì)胞液用于測(cè)定IGF-Ⅰ濃度，收集細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期以及增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞樣品采集

瘤胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸取1 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液置于-80 ℃保存，用于IGF-Ⅰ濃度測(cè)定。剩余細(xì)胞培養(yǎng)液在1 500 r/min下離心10 min，獲得細(xì)胞沉淀，同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，2種細(xì)胞沉淀混合后，用PBS(pH 7.4)洗滌2次。一部分細(xì)胞用75%的乙醇固定，4 ℃避光過(guò)夜用于細(xì)胞周期的檢測(cè)；一部分細(xì)胞用TRIzol試劑重懸，置于-80 ℃保存用于RNA的提取。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度測(cè)定和細(xì)胞周期檢測(cè)

使用細(xì)胞培養(yǎng)液IGF-Ⅰ測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度。使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)檢測(cè)細(xì)胞周期，采用FlowJo 7.6軟件進(jìn)行分析處理。

1.6 總RNA提取和cDNA合成

使用RNAiso Plus(TaKaRa公司，日本)從勻漿的瘤胃上皮組織中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó))測(cè)定提取的總RNA的濃度和純度。所有樣品的260/280 nm吸光度(OD)值介于1.80～2.10，表明RNA純度高。用1.4%瓊脂糖-甲醛凝膠評(píng)估RNA完整性。使用含RNA酶的TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.7 引物的合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物，并進(jìn)行BLAST比對(duì)。本研究中使用的所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列參見(jiàn)Liu等[7]。使用Q5 Real-time PCR儀(Applied Biosystems公司，美國(guó))對(duì)目的基因和GAPDH進(jìn)行定量。qRT-PCR在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，含有2 μL cDNA，0.8 μL引物(反應(yīng)中最終引物濃度為0.4 μmol/L)和SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa公司，日本)作為熒光染料。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。所有樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量計(jì)算參照Niwińska等[21]的2-△△Ct方法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。使用GraphPad Prism 6進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞周期的影響

如圖2所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，G0/G1期和S期細(xì)胞比例呈二次變化(P<0.05)。0和8 mmol/L丁酸鈉組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著高于0 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，而2 mmol/L丁酸鈉組顯著高于4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。4 mmol/L丁酸鈉組S期細(xì)胞比例顯著高于0、2和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著低于2 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。隨著丁酸鈉濃度的升高，G2/M期細(xì)胞比例呈線性降低(P<0.05)，8 mmol/L丁酸鈉組顯著降低于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。

2.2 不同濃度的丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞Cyclin和CDK mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖3所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細(xì)胞CyclinA2和CDKⅠ的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈線性降低(P<0.05)。8 mmol/L丁酸鈉組的CyclinA2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，8 mmol/L丁酸鈉組的CDKⅠ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于0和2 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈二次變化(P<0.05)。2和4 mmol/L丁酸鈉組的CyclinDⅠ mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)，且8 mmol/L丁酸鈉組顯著低于0 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)；4 mmol/L丁酸鈉組的CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0、2和8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)；2和4 mmol/L丁酸鈉組的CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于8 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。不同濃度的丁酸鈉對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞CyclinBⅠ、CyclinEⅠ和CDK2 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.3 不同濃度的丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖4所示，隨著丁酸鈉濃度的升高，羔羊瘤胃上皮細(xì)胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)的X蛋白(Bax)mRNA相對(duì)表達(dá)量呈線性升高(P<0.05)。8 mmol/L丁酸鈉組的Caspase-3和BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于0、2和4 mmol/L丁酸鈉組(P<0.05)。不同濃度的丁酸鈉對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8(Caspase-8)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2/BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

Cyclin A2：細(xì)胞周期蛋白 cyclin protein A2；Cyclin B1：細(xì)胞周期蛋白 cyclin protein B1；Cyclin D1：細(xì)胞周期蛋白 cyclin protein D1；Cyclin E1：細(xì)胞周期蛋白 cyclin protein E1；CDK1：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 cyclin dependent protein kinases 1；CDK2：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2 cyclin dependent protein kinases 2；CDK4：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4 cyclin dependent protein kinases 4；CDK6：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6 cyclin dependent protein kinases 6。圖6同 The same as Fig.6.

Caspase-3：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3 cysteinyl aspartate specific proteinase-3；Caspase-8：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8 cysteinyl aspartate specific proteinase-8；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2 B-cell lymphoma-2；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)的X蛋白 B-cell lymphoma-2-associated X protein；Bcl-2/Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2/B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)的X蛋白 B-cell lymphoma-2/B-cell lymphoma-2-associated X protein。圖7同 The same as Fig.7.

2.4 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度的影響

如圖5所示，丁酸鈉組的瘤胃上皮細(xì)胞IGF-ⅠRmRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度顯著高于對(duì)照組和抑制劑組(P<0.05)，但是對(duì)照組和抑制劑組之間IGF-ⅠRmRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度無(wú)顯著差異(P>0.05)。各組瘤胃上皮細(xì)胞IGF-Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA

2.5 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞Cyclin和CDK mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖6所示，丁酸鈉組瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ和CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和抑制劑組(P<0.05)。各組瘤胃上皮細(xì)胞CyclinA2、CyclinBⅠ、CyclinEⅠ、CDKⅠ、CDK2和CDK6 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖6 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

如圖7所示，各組瘤胃上皮細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bax和Bcl-2/BaxmRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

反芻動(dòng)物瘤胃上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育與細(xì)胞周期的變化密切相關(guān)。細(xì)胞周期的1個(gè)或多個(gè)階段的變化最終影響細(xì)胞的產(chǎn)生速率和最終的轉(zhuǎn)化時(shí)間[22]。細(xì)胞周期的每個(gè)階段(G0期、G1期、S期、G2期和M期)由Cyclin和CDK的活性控制[23]。Cyclin A2參與S期DNA復(fù)制的起始和完成[24]。從G1期進(jìn)入S期，Cyclin EⅠ替代Cyclin A2和CDK2起作用[25]。Cyclin A2-CDK2復(fù)合物通過(guò)磷酸化驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)濃縮對(duì)DNA復(fù)制具有重要作用[26]。Cyclin結(jié)合并激活其伴侶CDK，然后活性激酶使細(xì)胞內(nèi)的大量蛋白質(zhì)底物磷酸化以改變蛋白質(zhì)的活性，調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]，使細(xì)胞周期能夠順利進(jìn)行；如果有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)降低活性激酶的活性，那么Cyclin-CDK復(fù)合物的形成受到阻礙，阻止細(xì)胞周期的正常變化。Cyclin DⅠ、Cyclin D2、Cyclin D3及Cyclin E在G1期達(dá)到其合成和活性的高峰，調(diào)節(jié)細(xì)胞從G1期過(guò)渡到S期，保證細(xì)胞的增殖過(guò)程，而抑制Cyclin的表達(dá)會(huì)延長(zhǎng)細(xì)胞停留在G1期的時(shí)間，從而減少細(xì)胞的增殖[27]。同時(shí)，瘤胃上皮的發(fā)育也與細(xì)胞凋亡的變化密切相關(guān)，也是瘤胃上皮發(fā)育的重要組成部分，細(xì)胞凋亡進(jìn)程主要受Bcl-2和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)家族調(diào)控[28-30]。據(jù)報(bào)道，通過(guò)灌服丁酸鈉可以調(diào)控IGF-Ⅰ濃度來(lái)調(diào)控上皮細(xì)胞增殖的基因表達(dá)[7]。有研究表明，IGF-Ⅰ通過(guò)改變Cyclin DⅠ蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)Cyclin DⅠ-CDK4復(fù)合物的合成，推動(dòng)細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)[31]；在缺乏血清的情況下，添加IGF-Ⅰ可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的成纖維細(xì)胞Cyclin DⅠ蛋白表達(dá)，細(xì)胞周期恢復(fù)正常運(yùn)轉(zhuǎn)[19]。所以羔羊灌服一定量的丁酸鈉可能通過(guò)IGF-Ⅰ信號(hào)通路間接地調(diào)控瘤胃上皮細(xì)胞增殖。

圖7 丁酸鈉對(duì)IGF-ⅠR抑制劑處理的瘤胃上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

本文體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8 mmol/L的丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細(xì)胞24 h，增加了細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞比例，降低了細(xì)胞周期S期和G2/M期的細(xì)胞比例，同時(shí)下調(diào)了瘤胃上皮細(xì)胞CyclinA2、CyclinDⅠ和CDK6的表達(dá)，上調(diào)了凋亡基因Caspase-3和Bax的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明高濃度的丁酸鈉有抑制細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)，Gabel等[32]研究表明，當(dāng)灌服丁酸鈉濃度較高時(shí)，瘤胃上皮細(xì)胞的增殖在某一時(shí)刻停止，而細(xì)胞的分化程度增加。Baldwin等[33]研究表明，在持續(xù)灌服丁酸鈉168 h后，上調(diào)了與細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，同時(shí)下調(diào)了與瘤胃上皮細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)。與使用8 mmol/L丁酸鈉相比，使用2和4 mmol/L丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細(xì)胞24 h，上調(diào)了瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6的表達(dá)，且4 mmol/L丁酸鈉的作用優(yōu)于2 mmol/L丁酸鈉。CyclinDⅠ、CDK4和CDK6是G1期重要的Cyclin和相關(guān)依賴性激酶，推動(dòng)細(xì)胞周期G1期到S期的過(guò)渡[8]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)使用2和4 mmol/L丁酸鈉處理羔羊瘤胃上皮細(xì)胞24 h，降低了細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞比例，增加了S期的細(xì)胞比例，此結(jié)果與上調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ、CDK4和CDK6表達(dá)的結(jié)果相一致。上述結(jié)果說(shuō)明較低濃度的丁酸鈉具有加速細(xì)胞周期G1期到S期的過(guò)渡、推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖的作用。彭志鵬等[34]研究也表明，低濃度丁酸可以促進(jìn)體外培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高濃度的丁酸作用則相反。Gabel等[32]研究表明，高濃度丁酸可能會(huì)造成細(xì)胞分化和抑制上皮細(xì)胞增殖。Liu等[35]研究表明，5 mmol/L丁酸鈉處理瘤胃上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期階段沒(méi)有顯著影響，而8、10和20 mmol/L丁酸鈉處理增加了細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞比例，降低了S期和G2/M期的細(xì)胞比例，隨著丁酸鈉濃度的增加，這種作用越來(lái)越明顯。上述體外細(xì)胞試驗(yàn)研究表明，不同濃度的丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用不同，為了更具體研究丁酸鈉的促生長(zhǎng)作用機(jī)制，試驗(yàn)中篩選4 mmol/L丁酸鈉繼續(xù)培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞。但是加入丁酸鈉和IGF-ⅠR抑制劑明顯下調(diào)了CyclinDⅠ和CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量，說(shuō)明IGF-ⅠR抑制劑可能阻斷了IGF-Ⅰ信號(hào)通路，IGF-Ⅰ不能與受體結(jié)合激活相應(yīng)酶類，進(jìn)一步說(shuō)明IGF-Ⅰ信號(hào)通路對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

目前體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，羔羊瘤胃乳頭大小和表面積的增加證實(shí)了IGF-Ⅰ對(duì)瘤胃生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用[36-38]。在丁酸鈉灌服促進(jìn)羔羊瘤胃發(fā)育的同時(shí)，羔羊血漿IGF-Ⅰ濃度顯著提高，也上調(diào)了瘤胃上皮IGF-ⅠR和胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-5(IGFBP-5)的表達(dá)[7]。再次證實(shí)丁酸鈉可能是通過(guò)調(diào)控內(nèi)源IGF-Ⅰ的分泌，進(jìn)而通過(guò)IGF-Ⅰ信號(hào)通路來(lái)調(diào)控羔羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖和凋亡。在正常情況下，當(dāng)IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR結(jié)合后，其酪氨酸和絲氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化反應(yīng)，IGF-ⅠR的活化可以激活胰島素受體底物-Ⅰ(IRS-Ⅰ)、胰島素受體底物-2(IRS-2)、同源性和膠原蛋白(SHC)和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等多種底物，這些底物的活化啟動(dòng)了不同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別介導(dǎo)有絲分裂、細(xì)胞的增殖分化和抑制細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能[39-42]。本試驗(yàn)中通過(guò)PPP來(lái)抑制IGF-ⅠR的活性，PPP是一種常用的IGF-ⅠR抑制劑，可以與IGF-Ⅰ競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IGF-ⅠR達(dá)到抑制其活性的作用[38]。為了具體驗(yàn)證IGF-Ⅰ信號(hào)通路在丁酸鈉調(diào)控瘤胃上皮細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中的作用，在加入4 mmol/L丁酸鈉前1 h，通過(guò)加入IGF-ⅠR抑制劑來(lái)抑制IGF-Ⅰ信號(hào)通路，進(jìn)而觀察丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然4 mmol/L丁酸鈉處理對(duì)IGF-Ⅰ的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響，但4 mmol/L丁酸鈉處理升高了細(xì)胞液中IGF-Ⅰ濃度，上調(diào)了瘤胃上皮細(xì)胞IGF-ⅠR的mRNA相對(duì)表達(dá)量，而添加PPP抑制了瘤胃上皮細(xì)胞IGF-ⅠR、CyclinDⅠ和CDK4的mRNA相對(duì)表達(dá)量，并且降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中IGF-Ⅰ濃度。這說(shuō)明添加一定濃度的丁酸鈉增加了IGF-Ⅰ的合成，并且推動(dòng)瘤胃上皮細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖[43]；而4 mmol/L丁酸鈉處理的瘤胃上皮細(xì)胞IGF-Ⅰ的mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異，說(shuō)明本試驗(yàn)的樣品收集時(shí)間點(diǎn)可能存在缺陷，在今后的試驗(yàn)中需要增加樣品收集的時(shí)間點(diǎn)。一定濃度的IGF-Ⅰ可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的成纖維細(xì)胞Cyclin DⅠ蛋白表達(dá)和Cyclin-CDK4復(fù)合物合成，促進(jìn)其與CDK4異二聚體化，加快細(xì)胞周期從G1期到S期的轉(zhuǎn)變，并增加瘤胃上皮細(xì)胞的DNA合成量[44]。所以細(xì)胞液中較高濃度的IGF-Ⅰ是促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)育的重要因素[18]。本試驗(yàn)研究表明，抑制IGF-ⅠR能夠有效阻斷丁酸鈉對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ和CDK4的mRNA表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。所以IGF-Ⅰ必須與IGF-ⅠR結(jié)合以后才能上調(diào)瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ的表達(dá)，促進(jìn)其與相應(yīng)的CDK4形成復(fù)合物，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖[37]。Sell等[45]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小鼠IGF-ⅠR基因敲除后，體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞即使在培養(yǎng)基中添加再多的胎牛血清，其增殖速度仍遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞水平，延長(zhǎng)了細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間；血清饑餓法能使成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，而添加IGF-Ⅰ后，細(xì)胞能夠重新進(jìn)入S期，恢復(fù)細(xì)胞周期正常運(yùn)轉(zhuǎn)，但對(duì)缺失IGF-ⅠR基因的小鼠則沒(méi)有這種影響?？傊?，IGF-ⅠR是IGF-Ⅰ發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖作用的關(guān)鍵，只有兩者結(jié)合才能發(fā)揮促進(jìn)作用。

在本試驗(yàn)條件下，添加IGF-ⅠR抑制劑抑制了丁酸鈉對(duì)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞的增殖作用。而IGF-Ⅰ信號(hào)通路只有把細(xì)胞外的信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)才能對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮一系列調(diào)控功能[39-42,46]。目前公認(rèn)的IGF-Ⅰ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有3條：Ras/Raf/絲裂原激活蛋白激酶(MEK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和14-3-3蛋白/Raf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中，Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞增殖有關(guān)，然而14-3-3蛋白/Raf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要通過(guò)鈍化凋亡蛋白(BAD)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，而IGF-Ⅰ激活細(xì)胞膜上的IGF-ⅠR就是通過(guò)經(jīng)典的Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[14]。據(jù)Arunee等[47]報(bào)道，體外添加IGF-Ⅰ促進(jìn)小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞受體輔助因子(c-Raf)和ERK磷酸化，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑，加快細(xì)胞周期G1期進(jìn)程；相反，不論是否添加IGF-Ⅰ，只要Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑被阻斷則導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。盧勁曄[19]研究表明，體外添加IGF-Ⅰ提高ERK磷酸化水平，而當(dāng)ERK抑制劑抑制ERK磷酸化，則添加IGF-Ⅰ對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞CyclinDⅠ表達(dá)的促進(jìn)作用也被抑制。但是IGF-Ⅰ通過(guò)結(jié)合IGF-ⅠR激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)提高羔羊瘤胃上皮細(xì)胞周期G1期CyclinDⅠ和CDK4的mRNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)降低Caspase-3的mRNA相對(duì)表達(dá)量的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 體外培養(yǎng)細(xì)胞中添加2和4 mmol/L的丁酸鈉可促進(jìn)羔羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖，而添加8 mmol/L的丁酸鈉具有抑制細(xì)胞增殖、加快細(xì)胞凋亡的作用，說(shuō)明較低濃度的丁酸鈉可促進(jìn)體外培養(yǎng)瘤胃上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高濃度的丁酸鈉作用則相反。

② IGF-Ⅰ信號(hào)通路在丁酸鈉促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中具有重要作用，一定濃度的丁酸鈉可以促進(jìn)IGF-Ⅰ的分泌，IGF-Ⅰ與IGF-ⅠR結(jié)合后，推動(dòng)細(xì)胞從G1期過(guò)渡到S期，進(jìn)而促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞增殖。