高 歡 蔣曉旭* 楊玉婷 冉津銘 沈麗艷 蔣恒鑫 李雪艷 林秋葉 蔣慶文 曹振輝** 潘洪彬**

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201；2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，達(dá)州635000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料研究所，昆明650201)

養(yǎng)豬業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。仔豬是現(xiàn)代化養(yǎng)豬生產(chǎn)的核心，其健康狀況對(duì)后期的生長(zhǎng)發(fā)育具有極其重要的影響[2]。其中，腸道健康是仔豬生長(zhǎng)發(fā)育和快速生長(zhǎng)的基礎(chǔ)[3]。天然植物及其提取物作為飼料添加劑具有來(lái)源天然和不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，同時(shí)又具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、提高免疫力、抗應(yīng)激、改善腸道健康的作用。

博落回可用于治療疥癬、陰道滴蟲及殺蟲滅蛆等，最早記載于唐人陳藏器撰寫的《本草拾遺》中[4]。從博落回中分離得到的血根堿(sanguinarine，SG)是一種苯菲啶異喹啉生物堿，具有抗炎、抑菌、提高機(jī)體免疫力、改善腸道健康等功能[5-7]。SG作為飼料添加劑可部分替代抗生素，且SG的吸收快、分布快、代謝快，生物利用度較低，機(jī)體殘留量少[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)SG使雞小腸中CD3細(xì)胞數(shù)量減少，黏膜損傷減輕，從而有助于預(yù)防腸道細(xì)菌感染[11]。肉雞飼糧中添加SG可提高肉雞的生長(zhǎng)性能[12]。斷奶仔豬飼糧中添加SG可提高仔豬空腸和回腸絨毛高度，改善腸黏膜形態(tài)，提高小腸黏膜免疫功能，從而提高仔豬的平均日增重和平均日采食量[13-14]。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是細(xì)胞核內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，它在許多細(xì)胞刺激介導(dǎo)的細(xì)胞信息轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起核心作用。NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄亞基包括p65、p50、p52、RelB和c-Rel，所有成員間可形成同源或異源二聚體，在細(xì)胞中主要以p50/p65二聚體形式存在，其中p65亞基含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[15-16]。NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)通路參與體內(nèi)多種反應(yīng)過程，被認(rèn)為是經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號(hào)通路[17]。目前，SG影響仔豬腸道炎癥的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究提出SG通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞(IPEC-J2細(xì)胞)抗炎功能的設(shè)想，旨在闡明SG通過抑制NF-κB信號(hào)通路減輕IPEC-J2細(xì)胞炎癥的分子機(jī)制，以期為SG作為豬用飼料添加劑調(diào)控仔豬腸道健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

SG，分子式為C20H14NO4，相對(duì)分子質(zhì)量為332.33，含量為99.7%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；IPEC-J2細(xì)胞購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；過硫酸胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胰蛋白酶購(gòu)自Biological公司；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒購(gòu)自上海羽朵生物有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)α、p65、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

首先采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞促生長(zhǎng)作用的適宜濃度和時(shí)間以及構(gòu)建IPEC-J2細(xì)胞致炎模型LPS的適宜濃度和時(shí)間。首先，以不同濃度(0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL)SG處理IPEC-J2細(xì)胞24 h，研究其對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響；并進(jìn)一步研究0.500 μg/mL SG下不同時(shí)間(0、8、16、24、32、40 h)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響。其次，以不同濃度(0、0.2、1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL)LPS處理IPEC-J2細(xì)胞24 h，研究其對(duì)IL-6、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清中IL-6、IL-8含量的影響；并進(jìn)一步研究5.0 μg/mL LPS下不同時(shí)間(1、3、6、9、12 h)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清中IL-8含量的影響。

在確定SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的適宜濃度、時(shí)間和構(gòu)建LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞致炎模型的基礎(chǔ)上[18-20]，分別檢測(cè)對(duì)照組(無(wú)添加)、LPS致炎模型細(xì)胞組(LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h)和適宜濃度SG+LPS致炎模型細(xì)胞組(SG+LPS組，5.0 μg/mL LPS處理1 h和0.500 μg/mL SG處理24 h)在NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)基因和蛋白表達(dá)及其產(chǎn)物含量。

1.2.2 IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)

IPEC-J2細(xì)胞采用含5 mL培養(yǎng)基(含0.1%青鏈霉素抗體、10%FBS和90%DMEM高糖培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿(25 cm2)培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱，2 d傳代1次。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的IPEC-J2細(xì)胞，PBS清洗2～3次，胰蛋白酶消化4～6 min；加入含血清與雙抗的培養(yǎng)基3～4 mL懸浮細(xì)胞，充分混勻，靜置待用；取200 μL的細(xì)胞液和200 μL的臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行充分混勻，混合液靜置；使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板前需用酒精棉球進(jìn)行清理，取10 μL的混合液打入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，選取細(xì)胞計(jì)數(shù)板上四個(gè)角的方格進(jìn)行計(jì)數(shù)，并取平均值。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中豬的ACTB、IL-8、IL-6、核轉(zhuǎn)錄因子-κB1(NF-κB1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB2(NF-κB2)、RelB、核轉(zhuǎn)錄因子-κB亞基1(NF-κB1A)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB激酶抑制劑ε(IKKε)、腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)相關(guān)基因序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

1.2.5 mRNA表達(dá)量測(cè)定

實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系見表2。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃變性30 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試驗(yàn)

按照IL-6、IL-8和TNF-α的ELISA檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

分別提取IPEC-J2細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白和核蛋白。采用10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。將膜用TBS-吐溫20(TTBS)中漂洗，漂洗后用5%脫脂奶封閉1 h。分別用IκBα、p65一抗4 ℃孵育過夜，ACTB作為內(nèi)參，選用HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體4 ℃孵育2 h，暗室曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著者采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響

2.1.1 不同濃度SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響

由圖1可見，1.000和2.000 μg/mL的SG處理IPEC-J2細(xì)胞24 h，細(xì)胞明顯皺縮和死亡(圖1-E～圖1-F)，0～0.500 μg/mL的SG處理IPEC-J2細(xì)胞24 h后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化(圖1-A～圖1-D)。由表3可見，2和4倍稀釋條件下，與0 μg/mL SG組相比，1.000和2.000 μg/mL SG組的細(xì)胞數(shù)量顯著或極顯著減少(P<0.01)，0.500 μg/mL SG組細(xì)胞數(shù)量極顯著增加(P<0.01)。

2.1.2 0.500 μg/mL SG處理不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響

由表4可見，與0 h時(shí)相比，IPEC-J2平均細(xì)胞數(shù)量在16、24、32、40 h時(shí)極顯著升高(P<0.01)，且在24 h時(shí)達(dá)到最高值。

A～F的SG濃度分別為：0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μg/mL。

2.2 LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清中IL-6、IL-8含量的影響

2.2.1 不同濃度LPS對(duì)IPEC-J2細(xì)胞IL-6、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8含量的影響

由圖2可見，與0 μg/mL LPS組相比，1.0、5.0、25.0、125.0 μg/mL LPS組IPEC-J2細(xì)胞IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，1、5、25 μg/mL LPS組IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著或極顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，且5 μg/mL LPS組IL-6、IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量最高。不同濃度LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8含量均高于對(duì)照組，5 μg/mL LPS組細(xì)胞上清液中IL-6和IL-8含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2.2 5 μg/mL LPS處理不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清液中IL-8含量的影響

由圖3可見，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細(xì)胞1、3、6 h的IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于0 h(P<0.01)，5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細(xì)胞1 h時(shí)細(xì)胞上清液中IL-8含量極顯著高于0 h(P<0.01)，且5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細(xì)胞1 h時(shí)IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清液中IL-8含量最高。

表3 不同濃度SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞24 h活性的影響

表4 0.5 μg/mL的SG在不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞活性的影響

2.3 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NF-кB信號(hào)通路的影響

2.3.1 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NF-кB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖4可見，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞中IL-6、IL-8、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1、RelBmRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細(xì)胞中IL-6、NF-кB1A、NF-кB2、TNFAIP3、IKKε、NF-кB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖3 5 μg/mL LPS處理不同時(shí)間對(duì)IPEC-J2細(xì)胞IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞上清液中IL-8含量的影響

圖4 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.2 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α含量的影響

由圖5可見，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8含量均極顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞上清液中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，SG+LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8含量顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

圖5 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α含量的影響

2.3.3 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞中p65和IκBα蛋白表達(dá)量的影響

2.3.3.1 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞總蛋白中p65和IκBα蛋白表達(dá)量的影響

由圖6可見，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞總蛋白中IκBα、p65蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細(xì)胞總蛋白中的IκBα蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

2.3.3.2 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞核蛋白中p65蛋白表達(dá)量的影響

由圖7可見，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞核蛋白中p65蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組細(xì)胞核蛋白中p65蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

圖6 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞總蛋白中p65、IκBα蛋白表達(dá)量的影響

圖7 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞核蛋白中p65

2.3.3.3 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞胞漿蛋白中p65蛋白表達(dá)量的影響

由圖8可見，與對(duì)照組相比，LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；與LPS組相比，SG+LPS組胞漿蛋白中p65蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

圖8 SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞胞漿蛋白中p65

3 討 論

博落回提取物的主要有效成分SG早在1999年經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)可作為飼用添加劑[21]。以SG為主要成分的博落回提取物開發(fā)注冊(cè)為二類新中獸藥[(2011)新獸藥證字34號(hào))]，并獲得了獸藥添字批準(zhǔn)文號(hào)[獸藥添字(2012)180415250]，2019年12月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織修訂的《藥物飼料添加劑品種目錄及使用規(guī)范》依然將博落回提取物作為藥物飼料添加劑使用，成為飼料添加劑抗生素替代產(chǎn)品之一[22]。博落回提取物主要有效物質(zhì)SG顯著影響豬的增重、飼料轉(zhuǎn)化率[23]，其與益生菌聯(lián)合應(yīng)用具有預(yù)防肉雞壞死性腸炎的作用[24]。SG具有抑菌、抗炎、促生長(zhǎng)、抗寄生蟲等多種生物活性，適用于雞、豬、魚的健康養(yǎng)殖，對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)和國(guó)民食品安全具有重要意義[7,25-26]。

SG在體內(nèi)外均有明顯的抗炎作用，可減輕豬腸黏膜損傷，有助于預(yù)防腸道細(xì)菌感染[27]，同時(shí)SG具有減少仔豬腸上皮細(xì)胞的水分流失和/或增強(qiáng)腸道水分和營(yíng)養(yǎng)素吸收的功能[28]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的SG對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，SG終濃度為5～10 μmol/L時(shí)可明顯降低人乳腺癌MCF-7細(xì)胞存活率，并升高細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-8、Caspase-9活性[29]。通過SG對(duì)IPEC-1細(xì)胞增殖影響的研究表明，0.25～4.00 μg/mL的SG對(duì)IPEC-1細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用；而0.006 25～0.100 000 μg/mL的SG對(duì)IPEC-1細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，由此可見，低濃度的SG具有促進(jìn)IPEC-1細(xì)胞增殖的作用[30]。本研究以0.5 μg/mL SG處理IPEC-J2細(xì)胞24 h后細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高值，表明SG對(duì)IPEC-J2細(xì)胞促生長(zhǎng)作用的適宜濃度和時(shí)間分別為0.500 μg/mL和24 h。該結(jié)果的差異可能是不同細(xì)胞株對(duì)SG的耐受性不同所導(dǎo)致。

LPS作為一種典型腸毒素可引起豬產(chǎn)生細(xì)菌感染癥狀，是研究豬腸道炎癥反應(yīng)的常用藥物[31]。本研究以5 μg/mL LPS處理IPEC-J2細(xì)胞1 h，IL-8 mRNA相對(duì)表達(dá)量最高，表明構(gòu)建IPEC-J2細(xì)胞致炎模型LPS的適宜濃度和時(shí)間分別為5.0 μg/mL和1 h。

NF-кB信號(hào)通路是經(jīng)典的炎癥相關(guān)通路，激活后的NF-кB進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA模塊上的特異蛋白結(jié)合，指示細(xì)胞形成具有炎癥功能的蛋白復(fù)合物，最后這些蛋白激活炎癥并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[32-33]。其活化途徑是由LPS和致炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、TNF-α、細(xì)菌感染等觸發(fā)，細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，將侵襲信號(hào)傳遞給免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)增加，刺激因子產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、IL-8和TNF-α等細(xì)胞因子與受體結(jié)合，信號(hào)傳導(dǎo)至核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白激酶(IKK)復(fù)合物，從而激活炎癥反應(yīng)[34]。IKK復(fù)合物一旦激活，IκB在絲氨酸(Ser)32和Ser36位被磷酸化[35]，并通過26S蛋白酶體被降解，NF-κB二聚體從IκB/p50/p65復(fù)合物中解離，活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，與核內(nèi)多種靶基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，活化的NF-κB可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α等)、細(xì)胞黏附分子和抗原遞呈細(xì)胞表面主要組織相容性復(fù)合物-Ⅱ(MHC-Ⅱ)協(xié)同刺激因子的表達(dá)，還可刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induced nitrogen monoxide synthase，iNOS)和其自身抑制物IкBα的表達(dá)[36]。研究表明，活化的NF-κB引起的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致腸黏膜損傷[37]。所以，NF-κB活化是引起腸道黏膜損傷的關(guān)鍵生理因子。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)鉤吻中生物堿-鉤吻堿子可抑制NF-κB活化，從而減輕腸道炎癥反應(yīng)[38]。本研究中SG+LPS組細(xì)胞中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1等mRNA相對(duì)表達(dá)量及IL-6、IL-8含量顯著或極顯著低于LPS組，表明SG通過抑制IPEC-J2細(xì)胞炎癥模型的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)，減少IL-6、IL-8的分泌，減輕腸上皮細(xì)胞炎癥損傷，降低了IPEC-J2細(xì)胞炎癥癥狀。

在正常情況下，NF-κB位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，一般有2個(gè)功能亞單位，即p65和p50。NF-κB通常與IκB結(jié)合成無(wú)活性的形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)受氧化劑、細(xì)菌、毒素、炎癥細(xì)胞因子的刺激后被激活，經(jīng)歷快速磷酸化后IκB被非特異性蛋白酶水解，從而使p65蛋白的核定位信號(hào)暴露，導(dǎo)致NF-κB快速向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，結(jié)合在被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子序列上與之相同的κB位點(diǎn)，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成[39]。因此，p65蛋白的核轉(zhuǎn)移是NF-κB活化的重要前提與關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)，SG是NF-κB活化、IκBα磷酸化和降解的抑制劑[40]，同時(shí)p65、p50等亞基蛋白的核轉(zhuǎn)移有利于NF-κB的激活與炎癥的發(fā)展[18]。本研究顯示，與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞總蛋白中IκBα蛋白表達(dá)量極顯著降低，可能是因?yàn)镮κBα發(fā)生了磷酸化，細(xì)胞核蛋白中p65蛋白表達(dá)量顯著增加和胞漿中p65蛋白表達(dá)量極顯著減少，提示LPS使NF-κB激活從而促進(jìn)p65的核轉(zhuǎn)移；與LPS組相比，SG+LPS組細(xì)胞核蛋白中p65蛋白表達(dá)量極顯著下降，細(xì)胞胞漿蛋白中p65和細(xì)胞總蛋白中IκBα蛋白表達(dá)量極顯著升高，說(shuō)明SG抑制了p65核轉(zhuǎn)移，降低IκBα磷酸化，進(jìn)而抑制LPS致炎IPEC-J2細(xì)胞的NF-κB信號(hào)通路活化來(lái)降低炎癥的表達(dá)。

4 結(jié) 論

SG可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路中NF-κB1A、IKKε、NF-κB1、NF-κB2、TNFAIP3、IL-6、IL-8的表達(dá)，減少IL-6、IL-8的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)IPEC-J2細(xì)胞的抗炎能力；SG上調(diào)LPS致炎IPEC-J2細(xì)胞總蛋白中IκBα和胞漿蛋白中p65的蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞核蛋白中p65的蛋白表達(dá)，抑制了p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路活化，減輕IPEC-J2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。