肖敏敏 解 彪 楊 瀟 楊 玲 溫賢將 程冰冰 毛昌發(fā) 趙廣永*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100193；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，晉中030600)

高粱是全世界五大重要谷物之一。高粱耐鹽堿、耐干旱，對(duì)土壤、氣候等具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。高粱營養(yǎng)豐富，其主要營養(yǎng)成分與玉米相近。因此，高粱作為動(dòng)物的飼料原料具有重要的應(yīng)用價(jià)值。高粱籽實(shí)含有抗?fàn)I養(yǎng)因子——縮合單寧。Pan等[1]測(cè)定了28個(gè)不同品種高粱籽實(shí)的單寧含量，發(fā)現(xiàn)大部分品種的高粱單寧含量為0.67%～1.51%?？s合單寧極性很強(qiáng)，能夠與飼糧中的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成不易被瘤胃微生物降解的蛋白質(zhì)-單寧復(fù)合物[2-3]。因此，單寧對(duì)飼糧中蛋白質(zhì)具有過瘤胃保護(hù)作用。但是，很多研究顯示，飼糧中添加單寧會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的消化率下降。Yang等[4]的研究結(jié)果顯示，向肉牛飼糧中添加單寧酸降低了飼糧氮的消化率。Kronberg等[5]報(bào)道，飼糧中添加富含縮合單寧的胡枝子顆粒料，導(dǎo)致綿羊飼糧干物質(zhì)和氮的消化率下降。Koenig等[6]報(bào)道，向肉牛飼糧中添加黑荊樹(Acaciamearnsii)單寧提取物降低了飼糧氮的消化率。上述結(jié)果表明，在瘤胃中形成的蛋白質(zhì)-單寧復(fù)合物可能在反芻動(dòng)物后部消化道中分解不完全，因而導(dǎo)致飼糧氮消化率的下降。

聚乙二醇(PEG)是無毒、無味、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的乙二醇高聚物，在醫(yī)藥、食品、化工等眾多研究領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。PEG中的氫鍵能夠與單寧中的酚羥基結(jié)合形成穩(wěn)定的PEG-單寧復(fù)合物[7]。因此，單寧既能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，也能夠與PEG結(jié)合，形成相應(yīng)的復(fù)合物。也就是說，蛋白質(zhì)和PEG之間在與單寧結(jié)合方面存在競(jìng)爭作用。在飼糧中存在高粱單寧的條件下，添加PEG能否緩解高粱單寧對(duì)瘤胃發(fā)酵的不利影響，提高營養(yǎng)物質(zhì)消化率，以及PEG在真胃中能否促進(jìn)單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物解離，釋放出蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)消化率，尚不清楚。本研究計(jì)劃采用體外兩步消化法研究高粱單寧提取物(STE)與PEG協(xié)同作用對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)和營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響，闡明STE對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響以及PEG能否緩解STE對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化造成的不利影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以精粗比為40∶60(干物質(zhì)基礎(chǔ))混合料作為體外發(fā)酵基質(zhì)，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

STE由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27985—2011測(cè)得單寧含量為61%(干物質(zhì)基礎(chǔ))。PEG(相對(duì)分子質(zhì)量為4 000，分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

以3頭體重約為500 kg并裝有永久性瘤胃瘺管的安格斯閹公牛作為瘤胃液供體，每天06:30和19:30各飼喂1次。瘤胃液供體動(dòng)物飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 體外發(fā)酵基質(zhì)組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 瘤胃液供體牛飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗(yàn)方法

采用兩步消化法，分別模擬瘤胃發(fā)酵和真胃消化過程[9]，測(cè)定體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及干物質(zhì)消化率(DMD)和粗蛋白質(zhì)消化率(CPD)。

1.2.1 模擬瘤胃發(fā)酵

于早晨飼喂后2 h，通過瘤胃瘺管分別從3頭牛的瘤胃中采集200 mL瘤胃液，混合均勻，然后用4層紗布過濾。根據(jù)Zhao等[10]的方法配制緩沖液。按照4∶1(體積比)的比例將緩沖液與瘤胃液在39 ℃水浴鍋中混合均勻，并持續(xù)通入二氧化碳?xì)怏w。以容積為50 mL的離心管作為發(fā)酵容器。準(zhǔn)確稱取0.400 0 g風(fēng)干發(fā)酵基質(zhì)(表1)樣品置于每個(gè)離心管中。每個(gè)離心管注入40 mL緩沖液與瘤胃液的混合液，蓋上橡皮塞。橡皮塞上裝有1支玻璃滴管，滴管的吸球上留有一條縫隙，以釋放發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體。然后放入溫度為39 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵。發(fā)酵48 h后，按放入順序依次取出離心管，置于冰上，終止發(fā)酵。用低溫高速離心機(jī)(TGL 20M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)在4 ℃和1 800×g條件下，將培養(yǎng)液離心15 min。取上清液，用酸度計(jì)(pH-HJ 90，北京航天計(jì)算機(jī)集團(tuán)有限公司)測(cè)定pH，然后放置在-20 ℃的冰柜中冷凍保存。離心沉淀用于模擬真胃消化過程。

1.2.2 模擬真胃消化

將2.0 g胃蛋白酶(15 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于850 mL去離子水中，加入100 mL 1 mol/L鹽酸(HCl)，稀釋至1 L，配制成胃蛋白酶溶液，該溶液中胃蛋白酶活性為30 000 U/mL。向體外瘤胃發(fā)酵的離心沉淀中加入40 mL新配制的胃蛋白酶溶液，然后將培養(yǎng)管放置在溫度為38 ℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，并不時(shí)搖晃混勻。消化48 h后，將樣品在4 ℃和1 800×g條件下離心(TGL 20M臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)15 min。分別收集上清液和離心沉淀，放置于-20 ℃的冰柜中冷凍保存。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分為3個(gè)試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置8個(gè)重復(fù)，另外設(shè)置3個(gè)空白。STE和PEG的添加量均以干物質(zhì)為基礎(chǔ)。試驗(yàn)1：分別向發(fā)酵基質(zhì)中添加0、0.50%、1.00%、2.00% STE作為試驗(yàn)處理，模擬體外瘤胃發(fā)酵和真胃消化過程。測(cè)定體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)pH、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度及兩步消化過程后的體外DMD和CPD；試驗(yàn)2：在向發(fā)酵基質(zhì)中添加1.50% STE的基礎(chǔ)上，分別添加0、0.75%、1.50%、3.00% PEG作為試驗(yàn)處理，試驗(yàn)方法、過程及測(cè)定指標(biāo)均與試驗(yàn)一相同；試驗(yàn)3：試驗(yàn)處理分為不添加STE和PEG(對(duì)照)、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE和3.00% PEG、瘤胃發(fā)酵階段添加1.50% STE+真胃消化階段添加3.00% PEG，試驗(yàn)方法、過程均與試驗(yàn)1相同，測(cè)定指標(biāo)為兩步消化過程后的體外DMD和CPD。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)AOAC(1990)[11]的方法測(cè)定發(fā)酵基質(zhì)及瘤胃液供體牛飼糧的干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量。根據(jù) Van Soest等[12]的方法，應(yīng)用ANKOM200纖維測(cè)定儀(A200i，美國Ankom科技公司)測(cè)定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。根據(jù)Broderick等[13]的苯酚次氯酸鈉比色法，應(yīng)用分光光度計(jì)(UV-1801，北京北分瑞利儀器有限公司)測(cè)定培養(yǎng)液中NH3-N濃度。應(yīng)用氣相色譜儀(TP-2060F，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司)測(cè)定培養(yǎng)液中VFA濃度，計(jì)算總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，然后應(yīng)用SAS 9.4 (2013)軟件中的one-way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法對(duì)各處理指標(biāo)進(jìn)行多重比較。以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以0.05≤P<0.10作為有變化趨勢(shì)的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 STE對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

表3中結(jié)果顯示，添加STE對(duì)培養(yǎng)液的pH沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%和1.00% STE顯著降低了培養(yǎng)液中TVFA濃度(P<0.05)，但是添加2.00% STE對(duì)TVFA濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50% STE顯著降低了培養(yǎng)液中乙酸、丙酸和丁酸濃度(P<0.05)，但是添加1.00%和2.00% STE對(duì)乙酸、丙酸和丁酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加2.00% STE顯著降低了培養(yǎng)液中戊酸濃度(P<0.05)，但是添加0.50%和1.00% STE對(duì)戊酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均顯著降低了培養(yǎng)液中異戊酸濃度(P<0.05)。不同添加量的STE導(dǎo)致培養(yǎng)液中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸濃度均呈現(xiàn)先降低后升高的二次曲線變化(P<0.05)，并導(dǎo)致異丁酸、戊酸和異戊酸濃度均呈現(xiàn)線性下降(P<0.05)，但對(duì)乙酸/丙酸及NH3-N濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均顯著降低了體外DMD和CPD(P<0.05)，并且導(dǎo)致體外DMD和CPD呈現(xiàn)線性和二次曲線變化(P<0.05)。

表3 STE對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響(試驗(yàn)1)

2.2 PEG協(xié)同STE對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

表4中結(jié)果顯示，在發(fā)酵基質(zhì)中含有1.50% STE的條件下，添加0.75% PEG顯著降低了培養(yǎng)液中TVFA、乙酸及丁酸濃度(P<0.05)，但是添加1.50%和3.00% PEG對(duì)TVFA、乙酸及丁酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。添加0.75%、1.50%和3.00% PEG對(duì)培養(yǎng)液的pH和丙酸、異丁酸濃度及乙酸/丙酸沒有顯著影響(P>0.05)。隨著PEG添加量的增加，培養(yǎng)液中TVFA和NH3-N濃度線性升高(P<0.05)，乙酸濃度呈先下降再升高的二次曲線變化(P<0.05)，戊酸(P=0.088)和異戊酸(P=0.067)濃度具有線性升高的趨勢(shì)。在發(fā)酵基質(zhì)中含有1.50% STE的條件下，添加0.75%、1.50%和3.00% PEG對(duì)體外DMD沒有顯著影響(P<0.05)，但是具有線性提高體外CPD的趨勢(shì)(P=0.089)。

2.3 PEG添加途徑對(duì)體外DMD和CPD的影響

表5中結(jié)果顯示，添加1.50% STE顯著降低了體外DMD(P<0.05)。在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加3.0%PEG對(duì)STE抑制體外DMD的影響均沒有緩解作用。添加1.50% STE顯著降低了體外CPD(P<0.05)。在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加3.0%PEG均緩解了STE對(duì)體外CPD的抑制作用。

3 討 論

瘤胃液pH是反映瘤胃發(fā)酵狀況的重要指標(biāo)。正常飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，成年牛的瘤胃液pH為5.5～7.0。Yildiz等[14]研究表明，在綿羊飼糧中添加185和370 g/d橡樹縮合單寧提取物對(duì)瘤胃液pH沒有顯著影響。在本試驗(yàn)中，向發(fā)酵基質(zhì)中添加不同水平的STE對(duì)培養(yǎng)液的pH沒有顯著影響，與前人研究結(jié)果一致。

表4 PEG協(xié)同STE對(duì)體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)及營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響(試驗(yàn)2)

表5 PEG添加途徑對(duì)體外DMD和CPD的影響(試驗(yàn)3)

飼糧中的碳水化合物在瘤胃可以被發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等VFA。VFA通過消化道吸收后被反芻動(dòng)物利用，是反芻動(dòng)物的主要能量來源[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加STE降低了培養(yǎng)液中TVFA濃度，而添加PEG則提高了培養(yǎng)液中TVFA濃度。這表明STE能夠抑制飼糧中碳水化合物的發(fā)酵，因而降低了TVFA的濃度。

前人研究結(jié)果顯示，飼糧中添加銀合歡縮合單寧降低了培養(yǎng)液中原蟲的數(shù)量[16]，飼糧中添加雞眼草縮合單寧降低了山羊瘤胃液中原蟲的數(shù)量[17]，而飼糧中添加單寧酸也降低了肉牛瘤胃中原蟲的相對(duì)豐度[4]。這些研究結(jié)果表明，縮合單寧和水解單寧均能夠降低瘤胃液中原蟲數(shù)量。還有研究顯示，飼糧中添加漆樹水解單寧能夠降低瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的相對(duì)豐度[18]。瘤胃原蟲及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌對(duì)于碳水化合物在瘤胃中的發(fā)酵具有重要作用，因此，本研究中STE降低培養(yǎng)液中TVFA濃度的原因可能是通過抑制瘤胃原蟲和部分瘤胃細(xì)菌的生長和活動(dòng)造成的結(jié)果。由于本研究沒有測(cè)定瘤胃微生物區(qū)系變化情況，STE究竟抑制了哪些瘤胃微生物的生長和活動(dòng)還需要進(jìn)一步研究。STE對(duì)培養(yǎng)液中不同VFA的影響不同，可能是STE對(duì)不同瘤胃微生物的作用不同所造成的。本研究結(jié)果顯示，在發(fā)酵基質(zhì)中含有STE的條件下，添加PEG能夠提高培養(yǎng)液中TVFA濃度。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是PEG與STE結(jié)合，緩解了STE對(duì)碳水化合物發(fā)酵的抑制作用。

Beauchemin等[19]研究結(jié)果顯示，飼糧中添加1%和2%(干物質(zhì)基礎(chǔ))的白堅(jiān)木單寧提取物，使肉牛瘤胃液的NH3-N濃度線性降低。Yang等[4]研究結(jié)果表明，肉牛飼糧中添加13.0 或26.0 g/kg的單寧酸顯著降低了瘤胃液的NH3-N濃度，而添加6.5 g/kg的單寧酸則對(duì)瘤胃液NH3-N濃度沒有顯著影響。單寧降低瘤胃液NH3-N濃度的原因可能有2個(gè)方面：一是單寧與蛋白質(zhì)結(jié)合形成了復(fù)合物，抑制了蛋白質(zhì)的降解；二是單寧抑制了瘤胃中蛋白質(zhì)降解菌的活性。而本研究中試驗(yàn)1的結(jié)果顯示，添加2.00%以下的STE對(duì)培養(yǎng)液中NH3-N濃度沒有顯著影響。蛋白質(zhì)降解提高NH3-N濃度，而微生物蛋白合成降低NH3-N濃度。因此，這可能是STE抑制了蛋白質(zhì)的降解，同時(shí)抑制了瘤胃微生物蛋白合成造成的。由于本研究的試驗(yàn)1沒有測(cè)定蛋白質(zhì)降解率和微生物蛋白合成量，因此，不能確定添加STE沒有影響培養(yǎng)液中NH3-N濃度的確切原因。

Arisya等[20]研究了栗樹單寧提取物、朱纓花單寧提取物及毛野牡丹單寧提取物對(duì)體外瘤胃發(fā)酵飼糧粗蛋白質(zhì)降解率的影響。結(jié)果表明，飼糧中添加2%(干物質(zhì)基礎(chǔ))不同來源的單寧提取物均降低了飼糧干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)的降解率。Yang等[4]向肉牛飼糧中添加26.0 g/kg DM單寧酸也顯著降低了飼糧的干物質(zhì)、有機(jī)物、粗蛋白質(zhì)的全消化道消化率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，向發(fā)酵基質(zhì)中添加0.50%、1.00%、2.00% STE均降低了體外DMD和CPD，這與Arisya等[20]和Yang等[4]的研究結(jié)果一致。STE降低DMD和CPD的原因可能是在瘤胃發(fā)酵階段單寧與飼糧蛋白質(zhì)結(jié)合形成了復(fù)合物，而在真胃消化階段這種復(fù)合物沒有被有效解離，因而降低了CPD和DMD。而本研究結(jié)果顯示，在瘤胃發(fā)酵階段或真胃消化階段添加PEG均提高了體外CPD。這可能是在瘤胃發(fā)酵階段，PEG與STE結(jié)合減少了STE與蛋白質(zhì)結(jié)合的機(jī)會(huì)，因而提高了CPD。而本研究中試驗(yàn)2的結(jié)果顯示，在發(fā)酵基質(zhì)中含有STE的條件下，添加PEG提高了培養(yǎng)液中NH3-N濃度。這與劉艷玲[21]的研究結(jié)果及本研究中添加PEG提高體外CPD的結(jié)果一致。關(guān)于PEG在真胃消化階段能否促進(jìn)單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離，還需要進(jìn)一步開展動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

① STE抑制碳水化合物在體外瘤胃中的發(fā)酵，降低培養(yǎng)液中TVFA濃度，并降低體外DMD和CPD。

② 在瘤胃發(fā)酵階段或者真胃消化階段添加PEG均能夠緩解STE對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化造成的抑制作用，提高體外DMD。在瘤胃發(fā)酵階段添加PEG能夠同時(shí)提高體外DMD和CPD。