楊寶鈺 王 嬌 顏軼男 阿依古麗·艾買爾 張?zhí)K江*

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾843300)

反芻動物瘤胃是一種復(fù)雜的微生物發(fā)酵系統(tǒng)，其中主要有細(xì)菌、原蟲、真菌三大類以及少量噬菌體，它們在瘤胃內(nèi)起到了將飼糧中的纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)物質(zhì)的重要作用[1-3]。據(jù)估算，每克瘤胃液中細(xì)菌總數(shù)為1010～1011個、原蟲數(shù)量為105～106個(瘤胃原生動物可能占瘤胃微生物量的50%[4])及厭氧真菌(游離孢子)數(shù)量為103～105個[5]。反芻動物具有通過瘤胃細(xì)菌、原蟲和真菌的高特異性種群的底物特異性酶活性消化植物多糖的能力[6]。其中瘤胃中各種酶的種類和數(shù)量受動物的年齡和飼糧類型的影響較大，而碳水化合物需要依靠這些酶系消化；當(dāng)反芻動物采食量增加時，瘤胃液原蟲數(shù)量會隨之減少，與此同時，果膠酶和纖維素酶活性增加較緩慢，木聚糖酶和淀粉酶活性增加較快[7-8]。飼糧中有50%～70%的纖維類營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃被消化，部分在大腸被微生物發(fā)酵；而淀粉以及多糖類物質(zhì)在消化道內(nèi)降解[9]。由于瘤胃微生物的多樣性與微生物、飼糧與宿主三者相互之間復(fù)雜的結(jié)構(gòu)互惠共生的關(guān)系，使得反芻動物營養(yǎng)研究的熱點主要集中在瘤胃調(diào)控等方面[10-11]。很多學(xué)者研究認(rèn)為，瘤胃微生物菌群具有穩(wěn)定性和可變性的特點，在奶牛不同生理階段組成結(jié)構(gòu)也不相同，其菌群的相互作用隨奶牛生理狀態(tài)改變，有助于促進(jìn)奶牛的健康生長和提高生產(chǎn)性能[12-14]。pH是衡量瘤胃微生物發(fā)酵及消化飼糧的一個重要指標(biāo)，飼喂高精料較多時，可以降低反芻動物咀嚼時間，加快飼料降解速率，隨著飼糧在胃部的流動，可提高揮發(fā)性脂肪酸(VFA)及丙酸濃度，降低瘤胃pH、甲烷及乙酸濃度[15-17]；當(dāng)瘤胃pH在6.46～6.80時，纖維素消化可以達(dá)到適宜環(huán)境[18-20]；飼糧中粗纖維含量較多時，纖維降解酶在瘤胃中的比例升高，寡糖降解酶比例降低[21]；飼糧中粗蛋白質(zhì)含量增多時，瘤胃消化道內(nèi)消化酶活性明顯提高[18]。前人的研究表明，飼糧類型、飼糧加工工藝及營養(yǎng)水平等均對反芻動物瘤胃pH、消化酶活性以及瘤胃微生物的數(shù)量有明顯的影響，并且有關(guān)瘤胃內(nèi)環(huán)境的研究多集中于不同飼糧組成對瘤胃VFA、氨態(tài)氮濃度及瘤胃微生物等方面的影響。然而，對反芻動物不同時間點瘤胃pH、消化酶活性及原蟲數(shù)量變化的研究鮮見報道。因此，本試驗以瘤胃瘺管奶牛為試驗動物，通過測定分析反芻動物采食飼糧前后不同時間點的瘤胃pH、消化酶活性、原蟲數(shù)量動態(tài)變化及種類組成，旨在探索瘤胃微生物環(huán)境日變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步調(diào)控瘤胃功能和鑒定原蟲形態(tài)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選擇3頭體重為(500±30) kg、泌乳胎次為2～4、健康狀況良好、裝永久性瘤胃瘺管的干乳期荷斯坦奶牛作為試驗瘤胃液供體，分圈單獨飼養(yǎng)。在塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實訓(xùn)基地開展試驗，試驗預(yù)試期前3天進(jìn)行驅(qū)蟲，自由飲水；每日在09:30和18:30各飼喂1次，每次投喂量為22.5 kg，持續(xù)采食時間為3 h左右。

1.2 試驗設(shè)計

為穩(wěn)定奶牛瘤胃微生物區(qū)系，試驗預(yù)試期14 d，正試期7 d。正試期第1、4、7天的09:00、12:00、14:00、16:00、18:00、21:00、23:00采集瘤胃液，測定各時間點瘤胃的pH、蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶的活性、原蟲數(shù)量及種類組成。

1.3 試驗飼糧

試驗所用基礎(chǔ)飼糧根據(jù)NRC(2001)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，可滿足干乳期奶牛的維持營養(yǎng)需要，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1?；A(chǔ)飼糧的精粗比控制在30∶70；其中甜高粱種植于阿拉爾市10團(tuán)農(nóng)場，蠟熟期收割后，青貯于塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實訓(xùn)基地青貯窖內(nèi)。

基礎(chǔ)飼糧中干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、鈣(Ca)、磷(P)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)等常規(guī)養(yǎng)分含量參照張麗英[22]《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》中的方法測定；產(chǎn)奶凈能(NEL)計算公式[23]如下：

NEL=ME×kl；
kl=0.60+0.24×(q-0.57)；
q=ME/GE (0

式中：kl是代謝能轉(zhuǎn)化為凈能的效率系數(shù)；q為飼料的代謝能與總能比值系數(shù)；總能(GE)、代謝能(ME)、NEL單位為MJ/kg。

1.4 樣品采集及指標(biāo)測定方法

1.4.1 瘤胃液的采集

通過奶牛瘤胃瘺管采集瘤胃前、中、后3個部位的瘤胃食糜，用手將瘤胃食糜中瘤胃液擠壓于保溫瓶中，不同部位瘤胃液混合裝置，將采集混勻的瘤胃液迅速帶回實驗室，備用。

1.4.2 瘤胃pH的測定

7個時間點未過濾瘤胃液各取100 mL，每個時間點瘤胃液樣品重復(fù)測定4次，用pH計(pHSJ-5，上海儀電科學(xué)儀器有限公司)測定其pH。

1.4.3 瘤胃消化酶活性的測定

采用相應(yīng)的酶聯(lián)免疫試劑盒(購自上海邦奕生物科技有限公司)對蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶5種酶活性進(jìn)行測定，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4 瘤胃原蟲的計數(shù)

參照王加啟[24]《反芻動物營養(yǎng)學(xué)研究方法》中瘤胃原蟲方法進(jìn)行計數(shù)，計算公式如下：

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4.5 瘤胃原蟲形態(tài)學(xué)的鑒定

根據(jù)在400倍的顯微鏡下進(jìn)行觀察，并參照馮仰廉[25]《反芻動物營養(yǎng)學(xué)》中提供的原蟲標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，從屬水平上對瘤胃原蟲進(jìn)行鑒定分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，以Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值和SEM表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 各時間點瘤胃pH、消化酶活性及原蟲數(shù)量動態(tài)變化

由表2可見，隨時間變化，瘤胃pH整體差異極顯著(P<0.01)，在6.58～6.80上下浮動，即在奶牛采食前瘤胃pH均處在較高水平，采食后隨飼糧進(jìn)入瘤胃，瘤胃pH迅速降低，然后隨瘤胃中飼糧減少，瘤胃pH逐漸恢復(fù)至采食前水平。奶牛采食前(09:00和18:00)瘤胃pH均高于采食5 h后(09:00—14:00和18:00—23:00)瘤胃pH，且瘤胃pH均差異顯著(P<0.05)。

表2 各時間點瘤胃pH、消化酶活性及原蟲數(shù)量動態(tài)變化

由表2可知，在瘤胃蛋白酶和淀粉酶活性方面，隨時間變化，瘤胃中蛋白酶、淀粉酶活性整體差異極顯著(P<0.01)，分別在156.16～173.26 U/L、31.25～34.54 U/mL變化，即在奶牛采食前這2個酶活性均維持在較低水平，采食后隨飼糧進(jìn)入瘤胃，酶活性迅速升高，然后隨飼糧消化，酶活性逐漸下降恢復(fù)至采食前水平。在第1次采食前(09:00)酶活性均低于第1次采食3 h后(09:00—12:00)酶活性，且酶活性均差異顯著(P<0.05)；在第2次采食前(18:00)酶活性均低于第2次采食5 h后(18:00—23:00)酶活性，且蛋白酶活性差異顯著(P<0.05)，但淀粉酶活性差異不顯著(P>0.05)。

由表2可見，在瘤胃果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶活性方面，隨時間變化，瘤胃中果膠酶活性整體差異極顯著(P<0.01)，木聚糖酶活性整體差異顯著(P<0.05)，纖維素酶活性整體差異極顯著(P<0.01)，分別在11.67～22.55 U/mL、1 003.82～1 286.96 U/L、13.98～21.85 mU/L發(fā)生變化，即在奶牛采食前3種酶活性維持在相對較低水平，采食后隨飼糧進(jìn)入瘤胃，酶活性緩慢升高(木聚糖酶活性迅速升高)，然后隨飼糧消化，酶活性逐漸下降，在較長時間維持較高水平，且第1次采食前(09:00)酶活性略高于第2次采食前(18:00)酶活性，最終恢復(fù)至采食前水平。在第1次采食前(09:00)酶活性均低于第1次采食5 h后(09:00—14:00)酶活性，且酶活性均差異顯著(P<0.05)；在第1次采食前(18:00)酶活性均低于第1次采食5 h后(18:00—23:00)酶活性，且酶活性均差異顯著(P<0.05)，但木聚糖酶活性差異不顯著(P>0.05)。

由表2可知，在瘤胃原蟲數(shù)量方面，隨時間變化，每毫升瘤胃液原蟲數(shù)量整體差異不顯著(P=0.38)，在2.67×105～4.00×105個凹凸變化，即在奶牛采食前原蟲數(shù)量相對較高，采食后隨著飼糧進(jìn)入瘤胃，瘤胃內(nèi)容物被稀釋，原蟲數(shù)量緩慢降低，然后隨食糜的排空，原蟲數(shù)量逐漸恢復(fù)至甚至高于原來水平，但采食前后原蟲數(shù)量均差異不顯著(P>0.05)。在采食前(09:00和18:00)原蟲數(shù)量比較接近，每毫升瘤胃液分別含有3.47×105和3.20×105個，均高于采食3 h后(09:00—12:00和18:00—21:00)瘤胃原蟲數(shù)量，但均差異不顯著(P>0.05)。

2.2 瘤胃原蟲形態(tài)學(xué)鑒定

對瘤胃原蟲染色后，在400倍的顯微鏡下觀察鑒定出了6個屬的12種原蟲，結(jié)果如下：

厚毛屬(Dasytricha)：周身纖毛，纖毛與蟲體中軸呈傾斜螺旋排列，有一個收縮空泡，無骨板(圖1-1)。

內(nèi)毛屬(Entodinium)：種類最多，頭部單處纖毛，無骨板，但因福爾馬林的作用，纖毛向內(nèi)縮在光學(xué)顯微鏡下基本看不到(圖1-2至圖1-7)。

鞘甲屬(Elytroplastron)：主要特征是具有4塊骨板，蟲體的上面的體表下(較大的2塊)和底面的體表下(較長的位于左側(cè)，較小的位于有前端)各2塊骨板，一般4個收縮空泡排列在大核的左面(圖1-8)。

單甲屬(Eremplastron)：僅有1塊骨板，位于蟲體上面，前端位于近口唇下面，隨核延伸(圖1-9至圖1-10)。

前毛屬(Epidinium)：有2束復(fù)合纖毛帶，但在不同的水平(圖1-11)。

后毛屬(Metadinium)：后毛屬屬于內(nèi)毛目雙毛亞科，此屬最大特征是大核類似“E”字型(圖1-12)。

3 討 論

3.1 瘤胃pH

瘤胃pH對維持瘤胃微生物的生長代謝發(fā)揮著重要作用，影響其變化的因素眾多(飼糧組成、唾液分泌、瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物利用、吸收效率等)，其中飼糧的組成結(jié)構(gòu)是關(guān)鍵性因素[26-27]。本研究的結(jié)果表明，隨時間變化，奶牛采食前瘤胃pH均處在較高水平，采食后隨飼糧進(jìn)入瘤胃，瘤胃pH迅速降低，最后恢復(fù)至采食前水平。王曉佳[28]認(rèn)為，各時間點瘤胃pH呈現(xiàn)凹凸線型變化，在采食3 h以后呈現(xiàn)最低值；王淑玲等[29]研究表明，如果瘤胃中VFA濃度超過唾液的緩沖能力和瘤胃上皮的吸收能力就會導(dǎo)致瘤胃內(nèi)VFA的積累和長時間的低pH狀態(tài)；崔爽青[30]研究認(rèn)為，原蟲降低了淀粉轉(zhuǎn)化為VFA的速率，間接的緩沖了瘤胃pH，穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境，均與本試驗結(jié)果趨勢一致。這說明了瘤胃pH的變化與食糜在瘤胃中降解產(chǎn)生VFA的量及唾液中緩沖鹽相互作用密不可分[27]。

A：標(biāo)準(zhǔn)圖譜；B：觀察圖譜。

3.2 瘤胃中消化酶活性

瘤胃微生物分泌的各種酶參與了飼糧在瘤胃內(nèi)消化的過程，微生物數(shù)量及活力決定了消化酶活性及飼糧消化速率[31]；其中蛋白酶和淀粉酶活性可以直觀表現(xiàn)出瘤胃中蛋白分解菌和淀粉分解菌的數(shù)量及活力，果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶活性可以直觀表現(xiàn)出瘤胃纖維分解菌的數(shù)量及活力[32]。微生物的生長速度與營養(yǎng)物質(zhì)存在很強相關(guān)性，它分泌的酶是其消化活動的表現(xiàn)[33]。

本試驗研究表明，在不同時間點的瘤胃蛋白酶和淀粉酶活性變化趨勢較相似，果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶活性變化趨勢基本相似。酶活性與其底物降解是相適應(yīng)的，這5種酶在奶牛采食前酶活性較低，在采食后因其容易消化，前2種酶活性快速上升，從而導(dǎo)致其活性維持較高的時間比纖維素酶及果膠酶短；后3種酶活性緩慢增加，這一結(jié)果與瘤胃消化降解粗纖維的消化生理功能是相一致的，后3種酶的主要功能是降解非淀粉多糖(NSP)，在一定程度上能反映瘤胃降解NSP的能力[34]。楊開倫等[35]研究表明，蛋白酶活性最高值出現(xiàn)在綿羊采食后3 h左右，然后在8 h左右下降至采食前的蛋白酶活性；李鈺琪等[36]研究中綿羊采食飼糧(試驗Ⅰ期對照組)后，瘤胃液蛋白酶和纖維素酶活性呈先升高后下降的變化趨勢；王曉東等[37]、蔡娟[38]研究表明，對照組小尾寒羊公羊的瘤胃液中蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶在不同時間點的活性均呈先升高后下降的趨勢，這些趨勢變化均與本試驗研究的結(jié)果一致。奶牛在采食后，纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶活性的增加，有利于粗纖維的消化降解，可為奶牛提供更多營養(yǎng)物質(zhì)。由于NSP類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相比淀粉類、糖類更不易消化。因此，以上纖維素酶、果膠酶活性緩慢的上升速度正是適應(yīng)其降解NSP特性的表現(xiàn)。

瘤胃反芻活動一般在夜間進(jìn)行，特別是在天剛黑時最活躍[39]，而且只有在奶牛大量采食較長的纖維飼糧時才會出現(xiàn)[40]；加之秸稈類飼糧中纖維素、木聚糖、果膠又是植物細(xì)胞壁的主要成分，三者按順序由外向內(nèi)排列于植物細(xì)胞壁[41]。這解釋了奶牛在第2次采食前(18:00)比第1次采食前(09:00)纖維素酶、木聚糖酶及果膠酶的活性維持在較高水平且持久性較長的現(xiàn)象。孫盛楠等[42]研究表明，在給山羊飼用苧麻青貯時，長纖維青貯飼料可以讓纖維素酶活性隨著時間的延長維持在一個相對較高的水平(晨飼后6 h纖維素酶活性顯著高于晨飼后0.5 h)，這也與本試驗研究結(jié)果一致。綜上所述，飼喂反芻動物的飼糧精粗比例、飼糧長度、瘤胃微生物數(shù)量及活力不同等因素可以改變瘤胃中幾種主要消化酶活性在不同時間點變化趨勢。

3.3 瘤胃原蟲數(shù)量變化

瘤胃原蟲數(shù)量變化應(yīng)該根據(jù)動物種類、采食時間、食糜停留時間、生理狀況、內(nèi)容物稀釋率、外流速率、飼糧類型、個體等不同條件進(jìn)行綜合評定[43-45]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨時間變化，奶牛采食前原蟲數(shù)量相對較高，采食后隨著飼糧進(jìn)入瘤胃，原蟲數(shù)量緩慢降低，最后原蟲數(shù)量逐漸恢復(fù)甚至高于原來水平。巴桑珠扎等[44]研究證明，伴隨黃牛采食飼糧及飲水，瘤胃液排空，原蟲數(shù)量明顯下降，隨后由于瘤胃中養(yǎng)分增加，其數(shù)量顯示上升，這一結(jié)果解釋了瘤胃原蟲在不同時間點的數(shù)量變化因素。王帥等[46]、方翟等[47]、王曉東等[37]研究表明，飼喂基礎(chǔ)飼糧后，瘤胃液的原蟲數(shù)量和不同屬的原蟲頻率在各個時間雖然有降有升，但均差異不顯著，這與本試驗研究結(jié)果一致。綜上所述，瘤胃原蟲數(shù)量變化是因為瘤胃內(nèi)容物被稀釋，原蟲數(shù)量緩慢降低，隨著新的可利用的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入瘤胃，原蟲將其利用，導(dǎo)致數(shù)量有所增加，然后使其維持于一個動態(tài)范圍內(nèi)。

3.4 瘤胃原蟲形態(tài)學(xué)鑒定

通過在光學(xué)顯微鏡下觀察，鑒別出了Dasytricha的反芻厚毛蟲；Entodinium的尾刺內(nèi)毛蟲、簡單內(nèi)毛蟲、雙凹內(nèi)毛蟲、Entodiniumchattenjeei、雙乳突內(nèi)毛蟲和雙葉內(nèi)毛蟲；Elytroplastron的水牛鞘甲蟲；Eremplastron的牛單甲蟲和雙葉單甲蟲；Epidinium的無尾前毛蟲；Metadinium的r型后毛蟲；共6個屬12種瘤胃原蟲，其中50%為Entodinium的原蟲。蔡娟等[48]、崔爽青等[49]及De la Fuente等[50]研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃原蟲中鑒別后發(fā)現(xiàn)，Entodinium的原蟲所占比例最高，與本研究結(jié)果一致，從而進(jìn)一步證明了該屬的原蟲有吞食淀粉和可溶性糖的能力，同時宿主采食高精飼糧后種屬的數(shù)量顯著升高[50-52]。目前國內(nèi)對瘤胃原蟲種屬鑒別比較全面的是吐爾遜阿依[53]在塔里木馬鹿瘤胃中共鑒別出16個屬176種原蟲；其次是桂榮等[54]對牛瘤胃纖毛蟲種類共檢出了18個屬57種纖毛蟲。而隨著分子生物的發(fā)展，不同的分子鑒別技術(shù)的完善，對原蟲種屬及數(shù)量鑒別方法也越來越多，如Lin等[55]利用454焦磷酸測序法、Kittelmann等[56]利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)、Singh等[57]利用實時熒光定量(real-time PCR)技術(shù)及劉旗[58]利用MiSeq測序平臺等各項技術(shù)方法均能鑒別出更多的瘤胃原蟲種屬及數(shù)量。綜上所述，本試驗鑒別瘤胃原蟲種屬及數(shù)量比較少的原因，是受鑒別技術(shù)、原蟲密度及自溶性等因素的影響。

4 結(jié) 論

① 在奶牛采食前后，隨時間變化，瘤胃pH均差異顯著；原蟲數(shù)量差異不顯著；蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶活性均差異顯著，后2種酶活性在第2次采食前后差異不顯著。

② 本次試驗共鑒別出了Dasytricha、Entodinium、Elytroplastron、Eremplastron、Epidinium和Metadinium6個屬的12種原蟲，其中50%屬于Entodinium的原蟲。