楊 超 田全華 陽 利 程 艷 賀志雄* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢430205；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128)

新生反芻動物在最初24～36 h內(nèi)，其腸上皮為具有從初乳中吸收大分子物質(zhì)能力的胎兒型腸上皮，營養(yǎng)物質(zhì)主要通過滲透作用被胎兒吸收，對新生胎兒后期的生長發(fā)育有重要的影響[1-3]。有研究報道，新生反芻動物在出生48 h后，其腸道逐漸趨于“關(guān)閉狀態(tài)”，腸上皮逐漸由具備吸收大分子營養(yǎng)物質(zhì)能力的胎兒型腸上皮更新為不能通透大分子物質(zhì)的成年型腸上皮[4]。

初乳除了含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有免疫球蛋白、維生素、激素、生長因子、細(xì)胞因子和酶等生物活性物質(zhì)，具有促進(jìn)動物生長發(fā)育、完善其免疫功能的作用[5]。新生動物及時攝入足量的初乳會盡快建立自身被動免疫，從而降低腸道和呼吸系統(tǒng)疾病[6-7]。腸道微生物按其黏附位置的不同可分為食糜黏附微生物和組織黏附微生物，其中組織黏附微生物數(shù)量遠(yuǎn)低于食糜黏附微生物，但其對幼齡動物的影響比食糜黏附微生物更為重要[8]。據(jù)報道，初乳可調(diào)控新生反芻動物腸道發(fā)育和腸道微生物的定植過程，例如，新生犢牛在出生后12 h內(nèi)飼喂初乳顯著提高了其小腸黏膜中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的相對豐度，并阻止了大腸桿菌(Escherichiacoli)的定植[9]。對新生動物而言，小腸段主要負(fù)責(zé)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其中初乳中大分子營養(yǎng)物質(zhì)主要通過空腸段吸收[10]。因此，本試驗擬選擇新生羔羊空腸為研究對象，探究飼喂初乳對其腸道滲透性及其黏附微生物組成的影響，以期為新生羔羊初乳飼喂策略的完善及健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

本試驗選取初生重[(1.99±0.08) kg]相近、健康狀況良好、未采食母體初乳的新生贛西黑山羊16只，隨機(jī)分為2組(每組8只)，分別飼喂代乳料(代乳料組)和初乳(初乳組)。代乳粉購自北京精準(zhǔn)動物營養(yǎng)研究中心，其營養(yǎng)成分含量見表1。代乳料按照代乳粉和溫水1∶5的比例進(jìn)行配制，攪拌混勻至充分溶解后，室溫晾至40 ℃并用奶瓶進(jìn)行飼喂。由于山羊初乳收集難度較大，加之山羊初乳由于羊關(guān)節(jié)炎-腦炎(caprine arthritis-encephalitis，CAE)病毒的污染，被新生山羊攝入后會導(dǎo)致其高發(fā)病率和致死率[11-12]。為減少疾病發(fā)生率，生產(chǎn)中通常使用牛初乳來飼喂新生山羊作為免疫球蛋白的供體，從而抵御CAE初乳的感染[13]。本試驗所用初乳收集自湖南省優(yōu)卓牧業(yè)牧場的5頭奶牛(分娩后24 h內(nèi))，所有初乳充分混勻后進(jìn)行飼喂，初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量為15.43 mg/mL，具體營養(yǎng)成分含量見表1。

羔羊在出生后迅速與母羊分離，用碘伏在臍帶處消毒，并使用干毛巾擦拭完身上黏液，稱量其初生重并做記錄。新生羔羊分組后單欄飼養(yǎng)，使用保溫?zé)暨M(jìn)行保暖，并在出生后2 h內(nèi)喂完代乳料或初乳。飼喂前對奶瓶進(jìn)行清洗和消毒，晾干后使用。飼喂前后用濕毛巾將羔羊口部周圍擦拭干凈。代乳料組羔羊出生后2 h內(nèi)飼喂5%體重的代乳料，初乳組羔羊在出生后2 h內(nèi)飼喂5%體重的牛初乳，初乳飼喂量參照Moretti等[10]的報道。為測定羔羊腸道滲透性，分別從2組新生羔羊中隨機(jī)選取6只，在代乳料和初乳中分別添加0.5 g甘露醇和1.0 g乳果糖進(jìn)行飼喂，甘露醇和乳果糖飼喂量及血液采集時間點參照Minuti等[14]的報道。所有羔羊在出生后12 h屠宰取樣。

表1 代乳粉和初乳營養(yǎng)成分含量

1.2 樣品采集

用于腸道滲透性檢測的羔羊分別在喂完初乳或代乳料0、2、4、6、8、10 h時頸靜脈采血，使用5 mL抗凝采血管收集血液，在室溫下以3 000×g離心15 min分離血漿，置于-20 ℃保存用于后續(xù)腸道滲透性指標(biāo)測定。所有羔羊經(jīng)頸靜脈放血致死后，迅速分離出空腸前段組織(距十二指腸5 cm處)，截取1 cm×3 cm的組織塊，用生理鹽水沖洗干凈內(nèi)容物后置于-80 ℃保存，用于DNA提取。

1.3 腸道滲透性測定

將各時間點血漿樣品在4 ℃融解后12 000 r/min離心10 min，吸取上清至新的1.5 mL離心管，隨后取400 μL并加入25 μL內(nèi)標(biāo)蜜二水一糖溶液(80 μg/mL)，再加入800 μL乙腈渦旋混勻，靜置10 min以沉淀蛋白質(zhì)；之后12 000 r/min離心10 min，小心吸取全部上清，并向沉淀中加入400 μL水，渦旋混勻后靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清并將2次上清合并，使用離心濃縮儀(Christ RVC2-18 CD plus)濃縮離心至干。吸取300 μL衍生試劑(體積比為4∶1的吡啶-甲醇溶液，含有32 mg/mL鹽酸羥胺和45 mg/mL 4-二甲氨基吡啶)加入衍生瓶，加蓋密封后在75 ℃條件下加熱30 min，其間振蕩數(shù)次；冷卻至室溫后加入1 mL乙酸酐，密封后在75 ℃條件下再次加熱20 min，待冷卻至室溫后加入1.5 mL二氯甲烷，充分振蕩。最后清除過量的衍生試劑：1)加入1 mL 1 mol/L HCl，緩慢振蕩30 s后移除水相，之后加入1 mL蒸餾水重復(fù)洗滌2次，在最后1次清洗過程中盡可能去除水相；2)剩余的有機(jī)相在40 ℃下離心濃縮揮干后，用200 μL的乙酸乙酯-正己烷混合溶劑(體積比為1∶1)溶解后，5 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移全部上清至配有內(nèi)插管的色譜進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法、色譜條件及質(zhì)譜圖譜的數(shù)據(jù)讀取等參照許麗衛(wèi)等[15]的方法。

1.4 空腸黏附微生物多樣性

空腸組織DNA提取使用動物組織DNA提取試劑盒(DP304，天根生化科技有限公司)進(jìn)行，提取完成后在NanoDrop 2000上進(jìn)行純度和濃度測定，并使用瓊脂糖凝膠(2%)電泳進(jìn)行DNA完整性檢測。采用細(xì)菌通用引物338F(引物序列為：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(引物序列為：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S DNA“V3+V4”高度可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化后進(jìn)行文庫構(gòu)建，質(zhì)檢合格的文庫基于Illumina HiSeq 2500平臺進(jìn)行高通量測序?；贔LASH(v1.2.11)軟件對測序得到的PE reads按照overlap長度進(jìn)行拼接得到原始Tags，之后使用Trimmomatic(v0.33)和UCHIME(v4.2)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后在相似度97%的水平上對序列進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于OTU對數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性分析，并基于分類學(xué)信息在門和屬分類水平上對微生物組成進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

血漿中甘露醇和乳果糖濃度變化相關(guān)指標(biāo)的計算方法參照Fischer等[16]的報道，其中曲線下方正增量面積采用梯形法則進(jìn)行計算，最大濃度變化量為最大濃度與初始濃度的差值。腸道形態(tài)學(xué)、滲透性指標(biāo)以及微生物相對豐度等數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019進(jìn)行初步整理后，采用SPSS 25.0軟件的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。試驗結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道滲透性

代乳料組和初乳組新生羔羊血漿中甘露醇濃度隨時間的變化趨勢如圖1所示，在各時間點2組新生羔羊血漿中甘露醇濃度無顯著差異(P>0.05)。由表2可知，代乳料組新生羔羊血漿中甘露醇達(dá)到最大濃度的平均時間為3.67 h，最大濃度為2.80 μg/mL，最大濃度變化量為2.26 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.76；初乳組新生羔羊血漿中甘露醇達(dá)到最大濃度的平均時間為3.33 h，最大濃度為3.16 μg/mL，最大濃度變化量為2.69 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.95。2組新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化相關(guān)指標(biāo)[達(dá)到最大濃度的平均時間、最大濃度、最大濃度與時間的比值、2 h曲線下方正增量面積、6 h曲線下方正增量面積、10 h曲線下方正增量面積及最大濃度變化量]均無顯著差異(P>0.05)。

圖1 新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化

代乳料組和初乳組新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化趨勢如圖2所示，在各時間點2組新生羔羊血漿中乳果糖濃度無顯著差異(P>0.05)。由表3可知，代乳料組新生羔羊血漿中乳果糖達(dá)到最大濃度的平均時間為4.00 h，最大濃度為2.75 μg/mL，最大濃度變化量為2.27 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.69；初乳組新生羔羊血漿中乳果糖達(dá)到最大濃度的平均時間為5.00 h，最大濃度為2.02 μg/mL，最大濃度變化量為1.57 μg/mL，最大濃度與時間的比值為0.40。2組新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化相關(guān)指標(biāo)[達(dá)到最大濃度的平均時間、最大濃度、最大濃度與時間的比值、2 h曲線下方正增量面積、6 h曲線下方正增量面積、10h曲線下方正增量面積及最大濃度變化量]均無顯著差異(P>0.05)。

表2 新生羔羊血漿中甘露醇濃度變化指標(biāo)

圖2 新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化

2.2 飼喂初乳對新生羔羊空腸黏附微生物組成的影響

2.2.1 α多樣性分析

如表4所示，代乳料組與初乳組測序分別得到97%相似度的OTU 343.25和435.75個，差異不顯著(P>0.05)，測序樣本覆蓋度2組間差異也不顯著(P>0.05)。基于OTU聚類結(jié)果進(jìn)行α多樣性分析，其中代乳料組ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)低于初乳組，但2組間無顯著差異(P>0.05)；初乳組Shannon指數(shù)顯著高于代乳料組(P<0.05)，而Simpson指數(shù)顯著低于代乳料組(P<0.05)，表明飼喂初乳顯著增加新生羔羊空腸黏附微生物多樣性。

2.2.2 β多樣性分析

β多樣性分析結(jié)果可清晰顯示不同組間樣本微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。主坐標(biāo)分析(PCoA)和非度量多維尺度(NMDS)分析2點間距離表示樣本間微生物群落的相似程度，樣本間距離越近，表明2個樣本微生物組成相似性越高。如圖3所示，2組樣本未明顯區(qū)分開，表明在OTU水平上代乳料組和初乳組新生羔羊的空腸黏附微生物群落組成相似性較高。

2.2.3 門水平上微生物組成

由表5可知，在門水平上變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為兩大優(yōu)勢菌門，二者之和在代乳料組和初乳組分別占總菌的81.43%和64.52%。初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門的相對豐度顯著低于代乳料組(P<0.05)，而厚壁菌門和Epsilonbacteraeota的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。

表3 新生羔羊血漿中乳果糖濃度變化指標(biāo)

表4 飼喂初乳對新生羔羊空腸黏附微生物α多樣性的影響

圖3 新生羔羊空腸黏附微生物主坐標(biāo)分析和非度量多維尺度分析

表5 空腸黏附微生物在門水平上的相對豐度

2.2.4 屬水平上微生物組成

由表6可知，飼喂初乳可顯著降低新生羔羊空腸黏附微生物中埃希氏菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)的相對豐度(P<0.05)，而初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中有益菌如乳桿菌屬(Lactobacillus)和雙歧桿菌屬的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。此外，初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中百伯史坦菌屬(Bibersteinia)、毛螺旋菌科UGG-008(Lachnospiraceae_UCG-008)、螺桿菌屬(Helicobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和未分類瘤胃球菌科相關(guān)菌屬(uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae)的相對豐度顯著高于代乳料組(P<0.05)。

表6 空腸黏附微生物在屬水平上的相對豐度

3 討 論

新生反芻動物由于特殊的胎盤結(jié)構(gòu)使其母體內(nèi)的抗體不能轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒側(cè)，出生后無被動免疫能力，容易受到外來病原菌的侵襲，從而威脅其生命。新生反芻動物只能通過及時從初乳中攝取免疫球蛋白來建立自身的被動免疫，以此抵御各類病原菌的侵襲[17]。據(jù)報道，在現(xiàn)代集約化生產(chǎn)中，約有50%的死亡新生犢牛是由腹瀉引起的，56%的疾病由胃腸道狀態(tài)紊亂引發(fā)[18-19]。因此，完善新生反芻動物飼養(yǎng)管理和初乳飼喂策略可極大提高其成活率。

初乳是新生反芻動物激素和生物活性因子的重要來源，與胃腸道的成熟和發(fā)育息息相關(guān)，其中除含有免疫球蛋白和營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有激素和促生長因子如胰島素樣生長因子(insulin growth factor，IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等[5,20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，分娩后第1天內(nèi)奶牛初乳和山羊初乳中總固形物、蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、灰分等營養(yǎng)成分含量無顯著差異[22]。奶牛和山羊分娩后第1次收集的初乳中IgG含量分別為59.8和41.9 mg/mL，免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量均較低且無顯著差異[23-24]。由于奶牛初乳易采集、泌乳量較山羊多、營養(yǎng)價值較山羊初乳高等特點，其在生產(chǎn)中替代山羊初乳具有可行性。

腸道滲透性是指腸道黏膜上皮被某些相對分子質(zhì)量大于150的物質(zhì)分子以非載體或通道介導(dǎo)的被動擴(kuò)散方式通過的特性，是檢測腸道完整性的重要指標(biāo)[25]。腸道滲透性主要受應(yīng)激、致病菌和炎癥等的影響，當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激、腸道受到致病菌侵襲或局部產(chǎn)生炎癥時，其滲透性增加，破壞腸上皮的完整性，從而影響其屏障作用的發(fā)揮[26]。然而，新生羔羊在出生后的24～48 h內(nèi)腸上皮類型為胎兒型，其主要特點是通透性大，可使大分子物質(zhì)以被動擴(kuò)散方式進(jìn)入腸上皮而被吸收進(jìn)入血液[4]。隨發(fā)育時間的延長，羔羊腸道逐漸“閉合”，腸上皮逐漸轉(zhuǎn)化為成年型腸上皮，對大分子物質(zhì)的通透性降低，其屏障作用增強(qiáng)。本試驗首次探究了山羊腸道滲透性的測定和分析方法以及初乳對其滲透性的調(diào)控作用，結(jié)果顯示飼喂初乳并不能在短時間(12 h)內(nèi)改變腸道滲透性，其通透性大小可能很大程度上與發(fā)育時間相關(guān)。

腸道微生物在宿主免疫系統(tǒng)發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)利用和整體生理方面起著至關(guān)重要的作用[27]。新生動物腸道微生物群落的建立與黏膜免疫系統(tǒng)和次級淋巴結(jié)構(gòu)的發(fā)育有關(guān)，其中某些特定的細(xì)菌屬能夠為腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生能量底物，出生后按時飼喂初乳可通過促進(jìn)腸道微生物的定植，對新生動物的健康起重要作用[28]。本試驗中，初乳組Shannon指數(shù)顯著高于代乳料組，而Simpson指數(shù)顯著低于代乳料組，Shannon指數(shù)越高且Simpson指數(shù)越低表明微生物群落多樣性越高。α多樣性分析結(jié)果表明，在出生后飼喂初乳可顯著提高新生羔羊腸道微生物群落的豐富度，并可增加腸道微生物群落的多樣性。在門水平上，新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門占比最高，其次為厚壁菌門和擬桿菌門，與Rey等[29]在犢牛上的研究結(jié)果一致。初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中厚壁菌門的相對豐度顯著高于代乳料組，表明其腸道微生物對碳水化合物和蛋白質(zhì)的消化吸收能力更強(qiáng)[30]。變形菌門中包含多種病原菌，代乳料組新生羔羊空腸黏附微生物中變形菌門的相對豐度顯著高于初乳組，表明飼喂初乳可抑制有害菌的定植。在屬水平上，初乳組新生羔羊空腸黏附微生物中未分類瘤胃球菌科相關(guān)菌屬、毛螺旋菌科UCG-008和脫硫弧菌屬的相對豐度顯著高于代乳料組，而瘤胃球菌通常被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)的有益菌[31]。毛螺旋菌科細(xì)菌通常參與動物體內(nèi)糖代謝，尤其是多糖降解過程[32]。據(jù)Jiao等[33]報道，脫硫弧菌屬的相對豐度與瘤胃氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸含量呈正相關(guān)，表明其可能參與動物體內(nèi)氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸代謝過程。雙歧桿菌屬作為一種益生菌被廣泛應(yīng)用，可調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答和免疫細(xì)胞表型，還可通過產(chǎn)生乙酸鹽來保護(hù)宿主免受腸道致病菌的感染[34]。乳桿菌屬可與腸道屏障發(fā)生相互作用，進(jìn)而起到維護(hù)腸道免疫系統(tǒng)的作用[35]。Fischer等[16]研究發(fā)現(xiàn)，出生后盡快飼喂初乳可顯著增加犢牛結(jié)腸黏膜中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對豐度，而大腸桿菌的相對豐度顯著降低，與本試驗結(jié)果相似，表明出生后盡快飼喂初乳可促進(jìn)有益菌定植，抑制有害菌定植，從而維持腸道健康。

4 結(jié) 論

新生羔羊出生后飼喂初乳對其腸道滲透性無影響，但可促進(jìn)新生羔羊腸道乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的定植，降低大腸桿菌等有害菌的定植，對維持腸道健康具有積極作用。