王昊宇 劉延芬 張克英 丁雪梅 白世平 王建萍 彭煥偉 玄 玥 宿卓薇 曾秋鳳

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部、農(nóng)業(yè)部和四川省重點實驗室，成都611130)

維生素D3是維生素D的一種活性形式，是調節(jié)動物體內鈣吸收和骨骼形成的重要激素前體，在肝細胞內經(jīng)25-羥化酶作用轉化成為25-羥基維生素D3(25-OH-D3)，且25-OH-D3是維生素D在動物機體內的活性代謝物[1]。Bar等[2]指出，25-OH-D3和維生素D3都能被禽類腸道所吸收。Atencio等[3]研究表明，14日齡的雛雞對25-OH-D3的吸收率(74.9%)高于對維生素D3的吸收率(66.5%)。在肉雞生長過程中，25-OH-D3在提高脛骨粗灰分含量上的效果優(yōu)于維生素D3[4]。當基礎飼糧中含有較低水平的維生素D3時，添加25-OH-D3對肉雞脛骨粗灰分含量的改進效果是維生素D3的2倍[5]。同時，在增重和降低肉雞脛骨發(fā)育不良方面，25-OH-D3也有較好的效果[6]。Cantor等[7]發(fā)現(xiàn)，25-OH-D3還可改善肉雞飼料轉化效率，并提高胸肌重量。25-OH-D3價格較維生素D3高，基于成本考慮傾向于將25-OH-D3和維生素D3在飼糧中配合使用。因此，為提高25-OH-D3和維生素D3聯(lián)合使用的效果，上海藥物研究所研發(fā)出了一種新型的25-OH-D3和維生素D3共晶。維生素共晶是在低于任一種組成物熔點的溫度下所有成分的融合，對比物理混合而言，維生素共晶具有結晶度高、吸濕性小的優(yōu)點，并形成規(guī)整的晶體形態(tài)，穩(wěn)定性增強，因而有利于提高其成藥性能[8]。因此，本試驗旨在通過研究25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨生長性能、免疫功能及脛骨發(fā)育的影響，初步探討25-OH-D3與維生素D3共晶在肉鴨上的作用效果，為新型飼料添加劑的研發(fā)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

25-OH-D3與維生素D3共晶中25-OH-D3與維生素D3比例為1∶1，又稱骨化二醇共晶，由上海藥物研究所提供。

試驗采用單因素設計，選擇360只1日齡櫻桃谷肉鴨，隨機分為3個組，每組6個重復，每個重復20只。T1組在基礎飼糧中添加69.0 μg/kg 25-OH-D3與66.0 μg/kg維生素D3物理混合物(即為飼糧提供5 520 IU/kg維生素D3)，T2組在基礎飼糧中添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶(即為飼糧提供5 520 IU/kg維生素D3)，T3組在基礎飼糧中添加67.5 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶(即為飼糧提供2 760 IU/kg維生素D3)。試驗期35 d，分為1～14日齡和15～35日齡2個階段。

1.2 試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

試驗飼糧參照NRC(1994)和我國《肉鴨飼養(yǎng)標準》(NY/T 2122—2012)配制?；A飼糧采用玉米-豆粕型飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗于2019年7—8月在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所試驗場進行，網(wǎng)上平養(yǎng)，24 h光照。自由采食和飲水。前期采用紅外燈給溫，溫控標準：1～3日齡30～32 ℃，4～7日齡28～30 ℃，以后每周降低2 ℃，直到24 ℃，并維持在24 ℃，其他管理按照常規(guī)進行。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 樣品采集

試驗第14天和第35天稱重后以重復為單位隨機選取接近均重的肉鴨1只(n=6)。稱量每只肉鴨宰前活重，頸靜脈采血，靜置后在4 ℃下4 000 r/min離心10 min，分離血清。另采集3 mL抗凝血，送到雅安市人民醫(yī)院測定血常規(guī)指標，包括白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞和嗜堿細胞數(shù)目與百分率。采血結束后，頸靜脈放血致死，剝離兩側脛骨，剔除附著的組織，4 ℃下保存用于后續(xù)測定。取左側胸肌置冰箱4 ℃貯存24 h后測定肉品質，最后分離脾臟、胸腺、法氏囊和肝臟，并稱重用于計算器官指數(shù)(器官重/活體重)。

1.3.2 指標測定

生長性能：在第1天、第14天和第35天以重復為單位記錄肉鴨體重，稱重前斷料8 h，結算余料。計算平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)，根據(jù)ADG和ADFI計算料重比(F/G)。

屠宰性能及肉品質：測定肉鴨活體重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、鴨胸肉和腿肌肉重，測定方法參照NY/T 823—2004進行。測定鴨胸肉品質，包括肉色[亮度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*)值]、剪切力和滴水損失，測定參照席鵬彬等[9]的方法。

血清免疫球蛋白含量：血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量采用免疫比濁法進行測定，檢測方法參照試劑盒說明書進行，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

血清骨代謝指標：血清鈣、磷含量及堿性磷酸酶(AKP)活性在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所溫江實驗室用自動生化分析儀進行檢測，采用甲基百里香酚藍(MTB)比色法測定血清鈣含量，采用磷鉬酸法測定血清磷含量，采用4-氨基安替吡啉比色法測定血清堿性磷酸酶活性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血清甲狀旁腺激素(PTH)和降鈣素(CT)含量，血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性及骨鈣素、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)含量使用ELISA試劑盒檢測，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

脛骨發(fā)育指標：采用WD-1型電子萬能試驗機測定骨強度，測定后于烘箱內105 ℃烘干后稱量脛骨重量；粗灰分含量的測定參照GB/T 6438—2007；鈣含量的測定參照GB/T 6436—2018；磷含量的測定參照GB/T 6437—2018。脛骨長度與寬度采用電子游標卡尺進行測量；寬度選取3個點測量結果取均值，精確到0.02 mm。將脛骨近端沿其頂部縱向切開，用電子游標卡尺測定生長板寬度和厚度，計算其指數(shù)和橫截面積。

生長板寬度系數(shù)=生長板寬度/脛骨長度；
生長板厚度系數(shù)=生長板厚度/脛骨長度；
橫截面積=生長板寬度×生長板厚度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件的一般線性模型(GLM)過程進行單因素方差分析，用LSD法進行多重比較。試驗結果以平均值和均值標準誤表示，以P≤0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨生長性能的影響

如表2所示，與T1組相比，T2組肉鴨35日齡體重以及15～35日齡和1～35日齡ADG和ADFI顯著提高(P<0.05)，但F/G無顯著差異(P>0.05)；T3組肉鴨1～35日齡ADG和15～35日齡ADFI顯著提高(P<0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨生長性能指標均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨屠宰性能和肉品質的影響

如表3所示，與T1組相比，T2組肉鴨35日齡胸肌肉色L*值顯著增加(P<0.05)，而其他屠宰性能和肉品質指標無顯著差異(P>0.05)；T3組肉鴨屠宰性能和肉品質指標無顯著差異(P>0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨35日齡胸肌剪切力顯著提高(P<0.05)。

表2 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨生長性能的影響

表3 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨屠宰性能和肉品質的影響

續(xù)表3項目Items組別 GroupsT1T2T3均值標準誤SEM胸肌率 Breast muscle rate/%10.069.149.220.68腿肌率 Leg muscle rate/%14.6813.7613.430.76肉色 Meat color亮度 L*51.63a56.51b52.12ab1.87紅度 a*9.298.799.540.84黃度 b*4.084.054.461.04滴水損失 Drip loss/%3.062.722.490.38剪切力 Shear force/N 4.74ab4.16a 4.82b0.23

2.3 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨免疫功能的影響

2.3.1 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

如表4所示，與T1組相比，T2組肉鴨35日齡脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)；T3組肉鴨免疫器官指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨14日齡法氏囊指數(shù)和35日齡脾臟指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

表4 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

2.3.2 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨血常規(guī)指標的影響

如表5所示，與T1組相比，T2組肉鴨14和35日齡血常規(guī)指標無顯著差異(P>0.05)；T3組肉鴨14日齡血液嗜酸細胞百分率和35日齡血液單核細胞計數(shù)顯著增加(P<0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨14日齡血液中性粒細胞百分率、單核細胞百分率、嗜堿細胞百分率以及單核細胞計數(shù)顯著升高(P<0.05)，14日齡血液淋巴細胞百分率顯著降低(P<0.05)；但35日齡血常規(guī)指標無顯著差異(P>0.05)。

表5 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨血常規(guī)指標的影響

續(xù)表5項目Items組別 GroupsT1T2T3均值標準誤SEM35日齡 35 days of age88.5358.5194.5328.82中性粒細胞百分率 NEUT percentage/%14日齡 14 days of age8.37ab7.12a9.63b0.7135日齡 35 days of age7.808.308.763.05淋巴細胞百分率 LYM percentage/%14日齡 14 days of age86.32ab89.80a82.43b1.4435日齡 35 days of age85.2381.2783.624.54單核細胞百分率 MONO percentage/%14日齡 14 days of age4.76ab 2.43a6.58b1.2435日齡 35 days of age0.700.931.150.23嗜酸細胞百分率 EO percentage/%14日齡 14 days of age0.47a0.62ab1.25b0.2935日齡 35 days of age0.440.290.320.12嗜堿細胞百分率 BASO percentage/%14日齡 14 days of age0.08ab0.03a0.10b0.0235日齡 35 days of age0.130.070.140.04中性粒細胞計數(shù) NEUT count/(×109個/L)14日齡 14 days of age12.4311.019.972.9635日齡 35 days of age7.808.308.763.05淋巴細胞計數(shù) LYM count/(×109個/L)14日齡 14 days of age119.90136.6089.1928.435日齡 35 days of age79.8449.3284.6028.77單核細胞計數(shù) MONO count/(×109個/L)14日齡 14 days of age4.57ab2.36a5.30b0.9335日齡 35 days of age0.33a0.45ab0.72b0.11嗜酸細胞計數(shù) EO count/(×109個/L)14日齡 14 days of age0.560.741.070.2435日齡 35 days of age0.440.290.320.12嗜堿細胞計數(shù) BASO count/(×109個/L)14日齡 14 days of age0.090.110.080.0435日齡 35 days of age0.130.070.140.04

2.3.3 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨血清免疫球蛋白含量的影響

如表6所示，各組肉鴨14和35日齡血清免疫球蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

2.4 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨脛骨發(fā)育的影響

2.4.1 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨血清骨代謝相關指標的影響

如表7所示，與T1組相比，T2組14日齡血清Ⅰ型膠原C端肽含量和35日齡血清鈣含量顯著升高(P<0.05)；T3組14日齡血清鈣和降鈣素含量顯著降低(P<0.05)。與T2組相比，T3組14日齡血清降鈣素含量和35日齡血清鈣和Ⅰ型膠原C端肽含量顯著降低(P<0.05)。

2.4.2 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨脛骨發(fā)育的影響

如表8所示，與T1組相比，T2組肉鴨35日齡脛骨粗灰分含量顯著增加(P<0.05)；T3組肉鴨14日齡脛骨鈣含量以及35日齡脛骨體積和脛骨粗灰分含量顯著降低(P<0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨14日齡脛骨粗灰分和磷含量以及35日齡脛骨鈣含量顯著降低(P<0.05)。

表6 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨血清免疫球蛋白含量的影響

表8 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨脛骨發(fā)育的影響

2.4.3 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨脛骨生長板發(fā)育的影響

如表9所示，與T1組相比，T2組肉鴨35日齡脛骨生長板寬度和寬度系數(shù)顯著增加(P<0.05)；T3組肉鴨35日齡脛骨生長板厚度、厚度系數(shù)、寬度系數(shù)和橫截面積顯著增加(P<0.05)。與T2組相比，T3組肉鴨14日齡脛骨生長板寬度和寬度系數(shù)顯著增加(P<0.05)。

表9 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨生長板發(fā)育的影響

續(xù)表9項目Items組別 GroupsT1T2T3均值標準誤SEM寬度系數(shù) Width index14日齡 14 days of age0.14ab0.13a0.15b0.0135日齡 35 days of age0.12a0.13b0.13b0.01橫截面積 Cross-sectional area/mm214日齡 14 days of age20.9517.8221.222.1035日齡 35 days of age9.87a12.28ab14.23b1.46

3 討 論

3.1 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨生長性能、屠宰性能及肉品質的影響

25-OH-D3是目前唯一獲得一般公認安全級(GRAS)的維生素D3代謝物。研究認為，25-OH-D3不受腸道膽酸分泌和脂肪含量的影響，比維生素D3更易吸收[1]。維生素D的吸收與脂類相似，通過膽酸形成微團的形式吸收，而25-OH-D3則是直接吸收到門靜脈中，無須生成微團，也無須膽酸的存在，因此，25-OH-D3的吸收受腸道損傷的影響較?。?5-OH-D3添加到實際飼糧中時，會產(chǎn)生單獨使用維生素D或簡單地提高飼糧維生素D水平所不能獲得的效果[10]。本試驗結果顯示，與25-OH-D3與維生素D3物理混合相比，飼糧中添加25-OH-D3與維生素D3共晶提高了肉鴨的ADG和ADFI，且添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶的效果更好。維生素組成、生產(chǎn)工藝和添加形式的不同對其效價和利用率具有較大的影響。研究發(fā)現(xiàn)，相對于傳統(tǒng)維生素D，一種通過新型的光化學合成25-OH-D3的方法所得到的25-OH-D3晶體提高了原料利用率，有更好的生物效應，同時也節(jié)約了成本[11]。吳東峰[12]研究發(fā)現(xiàn)，相對于固體維生素，采用液體維生素后噴涂技術可提高異育銀鯽的生長性能和抗氧化能力。以上研究結果表明，維生素的形態(tài)可以影響其功能的發(fā)揮，25-OH-D3和維生素D3共晶可能比其物理混合具有更高的生物學效價，但需要進一步研究證實。

同時，本試驗也發(fā)現(xiàn)，相對135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶組，降低1/2的添加量(67.5 μg/kg)時肉鴨生長性能降低，表明維生素的添加量是影響其效果的重要因素。Edwards[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加27.5 μg/kg維生素D3和5.0 μg/kg 25-OH-D3對于肉雞ADG和F/G無顯著影響。Yarger等[14]試驗表明，飼糧中添加70 μg/kg 25-OH-D3可以顯著提高49日齡肉雞體重和胸肌率；但添加量到達105 μg/kg時，則會降低胸肌率[15]。也有研究表明，肉雞采食高劑量(100 μg/kg)25-OH-D3會出現(xiàn)腎組織鈣化[16]。

本試驗中，飼糧中添加25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨的屠宰性能及胸肌率、腿肌率無顯著影響，但添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶可改善肉色，增加肌肉嫩度。近年來，有研究表明，25-OH-D3會影響肉雞骨骼肌生長、肌纖維組成和大小[17]。由此推斷，25-OH-D3可能會影響肉色和肉品質。本試驗中，肉色L*、a*和b*值與Bozkurt等[18]研究結果一致，表明這些值在正常范圍內[17]。

3.2 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨免疫功能的影響

研究表明，維生素D受體可活化T細胞，激活巨噬細胞合成1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2-D3]，對免疫細胞的分化和增殖具有重要調節(jié)作用[18]。25-OH-D3在腎臟中轉化為1,25-(OH)2-D3。1,25-(OH)2-D3對單核/巨噬細胞有重要調節(jié)作用，可誘導單核細胞抵抗微生物的侵襲，保護細胞的正常功能并加快熱應激后正常組織蛋白質的合成，這對巨噬細胞在環(huán)境高溫下的存活及功能發(fā)揮具有重要意義[19]。李德發(fā)等[20]試驗表明，飼糧中添加適量維生素D3可提高動物機體免疫反應，增加抗體濃度。Chou等[21]研究表明，肉雞在感染沙門氏菌時，飼糧中添加25-OH-D3會改善其保護性體液免疫。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨的免疫功能能有一定影響，且具有劑量效應。從免疫器官指數(shù)和14日齡血常規(guī)指標可看出，67.5 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶組肉鴨體內免疫反應比135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶組更強烈。這種現(xiàn)象一方面說明機體免疫活化后需要消化營養(yǎng)物質，導致用于生長的營養(yǎng)物質減少，生長性能降低，這與生長性能指標一致；另一方面也說明免疫活化后是增強了抗病能力還是增加了機體對外界環(huán)境應激的敏感性，有待進一步研究證實。

3.3 25-OH-D3與維生素D3共晶對肉鴨骨代謝及脛骨發(fā)育的影響

鈣對家禽骨骼強度及其發(fā)育具有重要的生物學作用，飼糧中鈣水平下降會導致肉雞脛骨粗灰分含量的下降[21]，充足的鈣含量會提高骨骼礦物質沉積[22]。維生素D3及其代謝物可提高肉雞的鈣、磷利用率[23]。本試驗結果表明，與25-OH-D3與維生素D3物理混合相比，飼糧添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶顯著提高了35日齡肉鴨血清鈣含量；同是共晶的情況下，飼糧添加67.5 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶顯著降低了肉鴨14、35日齡血清鈣含量和14日齡血清降鈣素含量。有研究表明，只有一種礦物元素長期缺乏，超出動物的調節(jié)能力時，血液中礦物元素含量會降低，而血液中的鈣主要存在于血清之中[24]。這表明飼糧添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶能更好地促進脛骨發(fā)育及礦化。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，通過分泌骨基質礦化而形成新骨，破骨與成骨過程的平衡是維持正常骨量的關鍵[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加25-OH-D3會提高肉雞血清鈣含量，表明維生素D代謝物會對肉雞飼糧中鈣的利用有促進作用[18]。飼糧中維生素D3水平的變化會直接反映在肉雞脛骨粗灰分含量上[26]。本試驗結果顯示，與25-OH-D3與維生素D3共晶物理混合相比，飼糧添加25-OH-D3與維生素D3共晶顯著增加了肉鴨35日齡脛骨灰分含量；同是共晶的情況下，飼糧添加67.5 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶顯著降低了肉鴨14日齡脛骨粗灰分和磷含量以及35日齡脛骨鈣含量。張金龍等[27]研究表明，基礎飼糧中添加12.5和25.0 μg/kg 25-OH-D3會顯著提高肉雞脛骨重量及粗灰分、鈣、磷含量。Zhang等[28]也研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加69 μg/kg 25-OH-D3可增加肉仔雞脛骨鈣含量。

4 結 論

飼糧中添加25-OH-D3和維生素D3共晶對于肉鴨的生長性能、免疫功能、骨骼發(fā)育有顯著影響，且具有劑量依賴性，表現(xiàn)為添加135.0 μg/kg 25-OH-D3與維生素D3共晶效果更佳。