申仲健 郝永勝 孫培新 吳永保 張 博 唐 靜 黃 葦 張 琪 侯水生 謝 明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

維生素K是一組具有促凝血作用的脂溶性維生素[1-2]，主要包括維生素K1、維生素K2、維生素K3、維生素K4等。其中，維生素K1大量存在于綠色蔬菜和植物油中，維生素K2是一類可以從腸道細(xì)菌發(fā)酵獲得的活性物質(zhì)[3]，而維生素K3和維生素K4是人類通過化學(xué)合成的產(chǎn)物。目前，畜禽飼糧中的維生素K主要為維生素K3[4]。維生素K主要通過參與羧化維生素K依賴蛋白發(fā)揮其凝血、骨骼礦化、抑制血管鈣化等生理作用[5-10]，凝血酶原前體蛋白維生素K缺乏或拮抗劑Ⅱ誘導(dǎo)蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)和骨鈣素分別是與凝血和骨骼礦化相關(guān)的維生素K依賴蛋白[11]，可作為機體維生素K營養(yǎng)狀況的評價指標(biāo)。小鼠通過注射維生素K1可顯著降低血漿PIVKA-Ⅱ含量[12]，肉雞飼糧中添加維生素K3可顯著提高肉雞3周齡脛骨骨密度和顯著降低血清羧化不全骨鈣素含量[13]。NRC(1994)家禽營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)中推薦育雛期北京鴨維生素K營養(yǎng)需要量為0.5 mg/kg，但該推薦量是依據(jù)其他家禽數(shù)據(jù)確定，缺乏肉鴨方面試驗依據(jù)。目前，維生素K對肉鴨生長發(fā)育影響的研究未見報道。因此，本試驗通過研究不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能、脛骨質(zhì)量和凝血及骨代謝相關(guān)血漿生化指標(biāo)的影響，探討反映肉鴨維生素K營養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)，確定育雛期北京鴨維生素K營養(yǎng)需要參數(shù)，為肉鴨飼糧配制中維生素K的合理使用提供技術(shù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼糧

試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，設(shè)7個維生素K3添加水平(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg/kg)。試驗基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參考我國《肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》( NY/T 2122—2012)，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。通過在基礎(chǔ)飼糧中添加7個不同水平人工合成維生素K3(0、0.98、1.96、3.92、7.84、11.76和15.68 mg/kg，按照甲萘醌含量進(jìn)行換算)配制成7種試驗飼糧。維生素K3添加形式為亞硫酸氫鈉甲萘醌(甲萘醌含量為51%)，試驗飼糧均制成顆粒料。選擇448只1日齡健康雄性北京鴨，隨機分為7組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)8只鴨。各重復(fù)試驗鴨初始體重基本一致。試驗期為21 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)代謝能 ME/(MJ/kg)12.18 粗蛋白質(zhì) CP19.99 鈣 Ca0.71 有效磷 AP0.35 賴氨酸 Lys1.10 蛋氨酸 Met0.45 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.80 蘇氨酸 Thr0.84 色氨酸 Trp0.25 精氨酸 Arg1.36

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗鴨網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食與飲水，24 h光照。1～21日齡按試驗飼糧分組飼養(yǎng)，其他按常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。

1.3 樣品采集和指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能

分別于1和21日齡稱取各組各重復(fù)試驗鴨空腹體重和剩余飼料重，計算1～21日齡試驗鴨平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.3.2 血漿生化指標(biāo)

使用采血針和真空采血管采集21日齡北京鴨血液，從各組各重復(fù)隨機挑選試驗鴨2只，頸靜脈采血5 mL，置于肝素鈉抗凝管中，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，-20 ℃保存，用于血漿生化指標(biāo)的測定。其中，血漿中鈣、磷含量和堿性磷酸酶活性采用HITACHI7080全自動生化分析儀進(jìn)行測定分析，試劑盒購自邁克生物股份有限公司。血漿中PIVKA-Ⅱ含量采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定，采用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的試劑盒并用BiotekEpoch酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，計算血漿PIVKA-Ⅱ含量。血漿中骨鈣素和羧化不全骨鈣素含量同樣采用ELISA法測定，在450 nm波長下測定吸光度，試劑盒購自北京綠源伯德生物科技有限公司。通過血漿骨鈣素和羧化不全骨鈣素含量計算骨鈣素羧化率：

骨鈣素羧化率(%)=100×(血漿骨鈣素含量-
血漿羧化不全骨鈣素含量)/
血漿骨鈣素含量。

1.3.3 脛骨質(zhì)量

于21日齡，從各組各重復(fù)隨機挑選試驗鴨2只，頸靜脈采血后，處死，取試驗鴨左側(cè)脛骨測定脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積，采用GE Lunar iDXA雙能X射線骨密度儀進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.3統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GLM程序按完全隨機試驗設(shè)計進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行平均值之間的多重比較。試驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

如表2所示，不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨平均日增重、平均日采食量和料重比均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表2 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

2.2 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質(zhì)量和骨代謝相關(guān)血漿生化指標(biāo)的影響

如表3所示，不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿鈣、磷含量和堿性磷酸酶活性產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。4.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿鈣含量顯著高于0、0.5、1.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿磷含量顯著低于0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。2.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿堿性磷酸酶活性顯著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。

2.3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白含量的影響

如表5所示，不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿PIVKA-Ⅱ含量產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。8.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿PIVKA-Ⅱ含量最低，顯著低于0、0.5、1.0、2.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。不同維生素K3添加水平對血漿羧化不全骨鈣素和骨鈣素含量產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿羧化不全骨鈣素含量顯著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)，并且血漿骨鈣素含量也顯著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組(P<0.05)。不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨骨鈣素羧化率未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質(zhì)量的影響

表4 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨骨代謝相關(guān)血漿生化指標(biāo)的影響

表5 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白的影響

3 討 論

3.1 不同維生素K3添加水平對1～21日齡北京鴨生長性能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加維生素K3未顯著提高豬生長育肥階段的平均日采食量、平均日增重和料重比[14-15]，同時對1～3周齡肉雞生長性能的影響也不顯著[13]。Price等[16]給大鼠持續(xù)服用維生素K拮抗劑造成大鼠維生素K缺乏，但未對大鼠平均日增重產(chǎn)生顯著影響。有關(guān)維生素K對北京鴨生長性能影響的研究還未見報道。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加不同水平維生素K3對1～21日齡北京鴨的平均日采食量、平均日增重和料重比均無顯著影響，這與上述研究報道基本一致。然而，維生素K對動物生長性能的影響與維生素K缺乏持續(xù)時間有關(guān)。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，盡管維生素K缺乏對1～3周齡肉仔雞平均日增重沒有顯著影響，但持續(xù)飼喂維生素K缺乏飼糧7周以后可顯著降低6～7周齡肉仔雞平均日增重。由此可見，維生素K對肉鴨生長發(fā)育的影響在生長性能等宏觀指標(biāo)上可能體現(xiàn)較弱，研究應(yīng)注重維生素K對機體生理生化機能的影響。

3.2 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨脛骨質(zhì)量和骨代謝相關(guān)血漿生化指標(biāo)的影響

Price等[16]研究發(fā)現(xiàn)，服用維生素K拮抗劑組的大鼠與對照組大鼠脛骨密度無顯著差異，骨質(zhì)疏松患者補充維生素K后骨密度并沒有顯著升高，但在臨床上補充維生素K可降低患者的骨折風(fēng)險[17]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加不同水平維生素K3對21日齡北京鴨的脛骨骨密度、骨礦鹽含量和骨面積都沒有產(chǎn)生顯著影響，這與上述研究結(jié)果基本一致。但本試驗結(jié)果表明提高飼糧維生素K3添加水平可促進(jìn)鈣、磷吸收及代謝，表現(xiàn)在提高飼糧維生素K3添加水平可提高血漿鈣、磷含量。這與肉雞方面的研究結(jié)果[13]相一致。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞骨礦化的標(biāo)志物，堿性磷酸酶活性升高間接反映成骨細(xì)胞代謝更活躍。醫(yī)學(xué)臨床上給骨折早期患者補充較高水平維生素K4可顯著提高患者血清堿性磷酸酶活性[18]。大鼠離體骨細(xì)胞培養(yǎng)試驗也表明，維生素K2能夠顯著增強血清堿性磷酸酶活性[19]。本試驗中2.0 mg/kg維生素K3添加水平組血漿堿性磷酸酶活性顯著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg維生素K3添加水平組的結(jié)果在一定程度上支持了上述研究報道。由此可見，維生素K可能通過參與體內(nèi)鈣、磷代謝調(diào)控機體骨骼發(fā)育。然而本試驗尚未觀察到不同維生素K3添加水平對北京鴨脛骨質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，這有待于進(jìn)一步研究。

3.3 不同維生素K3添加水平對21日齡北京鴨血漿維生素K依賴蛋白含量的影響

凝血功能是維生素K的主要生理功能[14,20-23]，凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ是與凝血相關(guān)的維生素K依賴蛋白，血漿PIVKA-Ⅱ含量也是目前最敏感的凝血指標(biāo)，能夠預(yù)測機體維生素K缺乏的亞臨床狀況[24-25]，當(dāng)機體維生素K缺乏時，PIVKA-Ⅱ在肝臟中未能及時的被羧化成為凝血酶原，隨后PIVKA-Ⅱ在血液中累積，而PIVKA-Ⅱ無法被激活成為凝血酶發(fā)揮凝血功能，血液中PIVKA-Ⅱ含量過高反映出凝血功能出現(xiàn)障礙[5,24,26]。本試驗結(jié)果顯示，血漿PIVKA-Ⅱ含量隨維生素K3添加水平升高而降低，且在飼糧維生素K3添加水平達(dá)到8.0 mg/kg時最低，這間接反映出維生素K缺乏可影響肉鴨的凝血功能。

此外，骨鈣素也是維生素K的依賴性蛋白[11,27]，當(dāng)機體維生素K缺乏時，部分骨鈣素?zé)o法在維生素K的作用下完成羧化反應(yīng)，血液中羧化不全骨鈣素含量會大大增加[28]，進(jìn)而導(dǎo)致血液中骨鈣素的含量也隨之增加，肉雞飼糧中添加維生素K3可顯著降低血清羧化不全骨鈣素含量[13]。因此，羧化不全骨鈣素是維生素K缺乏的生物標(biāo)志物，可作為評價維生素K營養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)[27,29]。羧化后的骨鈣素對羥基磷灰石晶體具有高親和力，使其沉積到骨基質(zhì)中，骨鈣素羧化率和骨密度在臨床上常用來作為骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)準(zhǔn)[29]，同時血漿羧化不全骨鈣素含量也被認(rèn)為是評估骨折風(fēng)險的敏感指標(biāo)[30]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加維生素K3可顯著降低北京鴨血漿羧化不全骨鈣素含量。這間接表明維生素K3參與了骨鈣素的羧化，這與本試驗中高維生素K3添加水平組骨鈣素羧化率升高相一致，也與飼糧中添加高水平維生素K3可顯著提高北京鴨血漿鈣含量的結(jié)果相一致。這在一定程度上表明，維生素K3可通過提高骨鈣素的羧化水平促進(jìn)肉鴨對鈣的吸收或動員。

目前，關(guān)于肉鴨維生素K3營養(yǎng)需要的研究未見報道。盡管本試驗設(shè)置了7個維生素K3添加水平，但尚不能成功通過構(gòu)建數(shù)學(xué)模型計算出北京鴨對維生素K3的適宜需要量。參考方差分析和平均值之間多重比較，與未添加維生素K3組相比，0.5 mg/kg維生素K3添加水平組血漿磷含量顯著升高，而血漿羧化不全骨鈣素含量顯著降低。這支持NRC(1994)家禽營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)中育雛期北京鴨維生素K3的推薦量(0.5 mg/kg)。同時，維生素K3添加水平高于0.5 mg/kg對升高血漿磷含量和降低血漿羧化不全骨鈣素含量沒有進(jìn)一步顯著改善作用。這提示在本試驗條件下，以血漿磷羧化不全骨鈣素含量為評價指標(biāo)，1～21日齡北京鴨飼糧中維生素K3適宜添加水平為0.5 mg/kg。同時，在飼糧中添加8.0 mg/kg維生素K3可顯著降低血漿中未羧化的凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ和羧化不全骨鈣素含量的試驗結(jié)果也暗示著，在特定情況下為促進(jìn)血液凝集功能和骨代謝相關(guān)機能，飼糧中維生素K3的添加水平可適當(dāng)提高。

4 結(jié) 論

飼糧中添加維生素K3可能通過參與羧化影響凝血酶原前體蛋白PIVKA-Ⅱ、骨鈣素等維生素K依賴蛋白的調(diào)控，進(jìn)而影響機體的血凝功能和骨代謝。綜合血漿磷和羧化不全骨鈣素含量，育雛期北京鴨飼糧維生素K3適宜添加水平為0.5 mg/kg。