王 超 顧云鋒 杜明芳 程業(yè)飛 何青芬 陳躍平 溫 超 周巖民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210095)

玉米是我國最主要的飼料原料，同時也是主要的儲備糧食品種之一，在保障糧食供應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。臨儲玉米儲存的平均年限通常為3年[1]，輪換后作為工業(yè)或飼料原料出售。近年來，隨著我國臨儲玉米庫存量的持續(xù)增加，部分玉米的儲存年限超過3年，稱為陳化玉米[2]。基于我國國情，陳化玉米今后將長期存在，因此，在飼料中合理利用陳化玉米尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，隨著儲存期的延長，玉米常規(guī)概略養(yǎng)分含量變化不明顯[3]，但玉米中脂質(zhì)易發(fā)生水解而使脂肪酸值增高，不飽和脂肪酸易氧化而產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)[4]。MDA可與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，使過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性降低[5]；自由基可引起蛋白質(zhì)發(fā)生氧化[6-8]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化率降低[8-9]。研究表明，飼喂陳化玉米可導(dǎo)致仔豬生長性能和抗氧化功能下降[10]，并引發(fā)黃膘肉現(xiàn)象[11]。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂陳化玉米會導(dǎo)致肉雞采食量降低和小腸形態(tài)受損。Qamar等[13]報道，飼喂陳化玉米對肉鴨的抗氧化功能和胸肌肉品質(zhì)有負(fù)面影響。近年來，我國蛋雞存欄數(shù)保持在12億～15億只，飼料需求量大。玉米在蛋雞飼糧中通常占50%以上，陳化玉米在蛋雞飼糧中的合理利用十分重要，但有關(guān)陳化玉米對蛋雞的影響則鮮見報道，特別是對蛋雞消化與抗氧化功能及蛋品質(zhì)的影響尚不清楚。因此，本研究選取儲藏4年的陳化玉米以不同比例等量替代飼糧中的正常玉米，探究陳化玉米對蛋雞生產(chǎn)性能、消化與抗氧化功能及蛋品質(zhì)的影響，以期為陳化玉米在蛋雞飼糧中的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用正常玉米和陳化玉米從安徽省黃山糧食儲備庫選取，儲存時間分別為1和4年，儲存條件符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 7415—2008規(guī)定的要求。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

將288只60周齡的海蘭褐蛋雞隨機分為4組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只蛋雞。采用不同比例陳化玉米等量替代基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米，分別為以下4種飼糧處理。1)對照組：基礎(chǔ)飼糧(正常玉米)；2)25%陳化玉米組：25%陳化玉米等量替代基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米；3)50%陳化玉米組：50%陳化玉米等量替代基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米；4)100%陳化玉米組：100%陳化玉米等量替代基礎(chǔ)飼糧中的正常玉米?；A(chǔ)飼糧參考NRC(1994)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗在南京市康欣禽業(yè)有限公司進(jìn)行，蛋雞采用3層階梯籠飼養(yǎng)。預(yù)試期1周，正試期8周。試驗期間蛋雞自由采食和飲水，每天16 h連續(xù)光照，每天上、下午分別喂料1次，室溫保持在18～23 ℃。

1.3 樣品采集

于試驗第28天和第56天從每重復(fù)隨機選取3個雞蛋用于雞蛋品質(zhì)測定。試驗結(jié)束時，于每個重復(fù)中隨機選取1只健康狀況良好的蛋雞，共24只，禁飼12 h(不禁水)。蛋雞稱重后，采用頸靜脈采血法用注射器刺入頸靜脈處采集5 mL左右血液于潔凈離心管中，待血清析出后于4 ℃條件下3 500 r/min離心15 min分離血清，并將血清置于-20 ℃條件下保存待測。血液采集完畢后，從頸椎脫臼處死蛋雞。待雞死亡后，立即剖開腹腔，分離肝臟、胰腺、前腸，取肝臟和胰腺放于自封袋中，-20 ℃保存待測。收集前腸食糜于離心管中，-20 ℃保存待測。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 正常玉米和陳化玉米的生化特性

正常玉米和陳化玉米常規(guī)概略養(yǎng)分含量按照張麗英[14]的方法測定，玉米脂肪酸值按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20570—2015的方法進(jìn)行測定。玉米MDA含量及CAT、POD活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)按照說明書進(jìn)行測定。玉米脂肪酸含量采用氣相色譜分析儀(GC-2010，日本島津公司)進(jìn)行測定，玉米氨基酸含量按照Yin等[15]的方法采用全自動氨基酸分析儀(L-8900，日本日立公司)進(jìn)行測定。玉米蛋白質(zhì)羰基(PC)、總巰基(T-SH)和游離巰基(SH)含量按照Zhang等[16]的方法進(jìn)行測定。

1.4.2 生產(chǎn)性能

試驗期間，每天記錄每個重復(fù)蛋雞的產(chǎn)蛋數(shù)、蛋重和死淘數(shù)，統(tǒng)計每周耗料量，計算產(chǎn)蛋率、平均日采食量、料蛋比和平均蛋重。

1.4.3 血清生化指標(biāo)

血清中葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定，測定方法按照說明書進(jìn)行。

1.4.4 消化酶活性

稱取0.3 g胰腺和前腸食糜樣品，將樣品與4 ℃預(yù)冷的生理鹽水按1∶9(質(zhì)量體積比)比例勻漿后于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃條件下保存待測。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)方法測定胰腺和前腸食糜中的胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.5 抗氧化指標(biāo)

采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定血清和肝臟的總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和CAT活性以及還原型谷胱甘肽(GSH)、MDA、PC和T-SH含量，操作過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.4.6 蛋品質(zhì)

于試驗第28天和第56天從每重復(fù)中隨機選取3個雞蛋，測定蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈夫單位、蛋黃顏色和蛋黃比例。采用蛋殼強度分析儀(Egg Force Reader，Orka，以色列)測定蛋殼強度；利用螺旋測微器分別測量蛋的中間、銳端以及鈍端3個位置的蛋殼厚度，取其平均值，精確到0.01 mm；采用多功能蛋品測定儀(EMT-5200，Robotmation，日本)測定蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色；用雞蛋分離器將蛋黃與蛋清分離，采用電子天平進(jìn)行稱重，計算蛋黃比例：

蛋黃比例(%)=[蛋黃重量(g)/蛋重(g)]×100。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行初步處理后，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間差異用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析，P<0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常玉米和陳化玉米的生化特性

由表2可知，正常玉米和陳化玉米的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均無明顯差異。與正常玉米相比，陳化玉米的不飽和脂肪酸含量降低，脂肪酸值及MDA、PC含量升高，CAT和POD活性及T-SH、SH含量降低。

表2 正常玉米與陳化玉米的生化特性(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項目 Items正常玉米 Normal corn陳化玉米 Aging corn過氧化氫酶 CAT/(U/mg prot)6.821.35過氧化物酶 POD/(U/mg prot)10.022.01蛋白質(zhì)羰基 PC/(nmol/mg prot)1.224.34總巰基 T-SH/(nmol/mg prot)17.1113.03游離巰基 SH/(nmol/mg prot)1.351.01

由表3可知，與正常玉米相比，陳化玉米中蛋氨酸、甘氨酸、賴氨酸和精氨酸含量下降。

表3 正常玉米與陳化玉米氨基酸含量分析

2.2 陳化玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表4可知，與對照組相比，100%陳化玉米組蛋雞產(chǎn)蛋率顯著降低(P<0.05)。各組之間蛋雞的平均日采食量、料蛋比和平均蛋重均無顯著差異(P>0.05)。

表4 陳化玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.3 陳化玉米對蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知，與對照組相比，100%陳化玉米組蛋雞血清GLU和ALB含量顯著下降(P<0.05)。

各組之間蛋雞的血清TC、TG、TP、GLB含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 陳化玉米對蛋雞血清生化指標(biāo)的影響

2.4 陳化玉米對蛋雞胰腺和前腸食糜消化酶活性的影響

由表6可知，與對照組相比，50%和100%陳化玉米組蛋雞的前腸食糜中胰蛋白酶活性顯著降低(P<0.05)。各組之間蛋雞的胰腺中胰蛋白酶活性以及胰腺和前腸食糜中脂肪酶、淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05)。

表6 陳化玉米對蛋雞胰腺和前腸食糜消化酶活性的影響

2.5 陳化玉米對蛋雞抗氧化功能的影響

由表7可知，與對照組相比，100%陳化玉米組蛋雞的血清MDA含量顯著升高(P<0.05)，25%、50%、100%陳化玉米組蛋雞的血清GSH-Px活性均顯著下降(P<0.05)。各組之間蛋雞的血清T-SH、PC和GSH含量以及T-AOC、T-SOD和CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

由表8可知，與對照組相比，50%和100%陳化玉米組蛋雞的肝臟MDA含量顯著升高(P<0.05)，100%陳化玉米組的蛋雞肝臟PC含量顯著升高(P<0.05)，50%和100%陳化玉米組的蛋雞肝臟GSH-Px活性顯著下降(P<0.05)，100%陳化玉米組蛋雞的肝臟CAT活性顯著下降(P<0.05)。各組之間蛋雞的肝臟T-SH和GSH含量以及T-AOC和T-SOD活性無顯著差異(P>0.05)。

2.6 陳化玉米對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表9可知，與對照組相比，試驗第56天100%陳化玉米組雞蛋的蛋黃顏色顯著降低(P<0.05)。各組之間試驗第28天和第56天雞蛋的蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈夫單位和蛋黃比例均無顯著差異(P>0.05)。

表7 陳化玉米對蛋雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

表8 陳化玉米對蛋雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

表9 陳化玉米對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

3 討 論

3.1 正常玉米和陳化玉米的生化特性

玉米在儲存過程中不可避免的會發(fā)生一系列生理和化學(xué)變化。研究表明，玉米經(jīng)過長時間儲存后，其脂質(zhì)易發(fā)生水解而使脂肪酸值升高，不飽和脂肪酸易氧化而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA[4]。本研究中，陳化玉米脂肪酸值高達(dá)109.18 mg KOH/100 g，屬重度不宜儲存，且陳化玉米中MDA含量升高，CAT和POD活性以及不飽和脂肪酸含量下降，表明陳化玉米已經(jīng)發(fā)生了脂質(zhì)氧化，而脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生羥自由基等自由基，這些自由基能引起蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)變化，降低可消化性。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)在氧化過程中，羥自由基攻擊蛋白質(zhì)側(cè)鏈的α碳原子或活性氧導(dǎo)致肽鏈斷裂會形成PC，SH也會被氧化成二硫鍵[6-8]。因此，PC、T-SH和SH含量是衡量蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)[17]。權(quán)萌萌等[6]報道，稻谷中PC含量隨著儲藏時間延長而增多。吳大偉等[18]發(fā)現(xiàn)，隨著儲存時間延長，豆粕中PC含量升高，而T-SH含量下降。尹陽陽等[19]報道，隨著儲藏時間延長，稻谷中T-SH含量減少，二硫鍵含量上升。本研究結(jié)果表明，與正常玉米相比，陳化玉米中PC含量升高，且T-SH含量降低，提示在儲存過程中部分蛋白質(zhì)發(fā)生了氧化。

3.2 陳化玉米對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

長期儲存導(dǎo)致陳化玉米脂質(zhì)過氧化與蛋白質(zhì)氧化程度加深，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，降低陳化玉米的營養(yǎng)價值，進(jìn)而影響攝食陳化玉米動物的生產(chǎn)性能[10-11]。朱正鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂30%陳化玉米飼糧使肉鴨的平均日增重顯著降低。Liu等[12]報道，飼喂100%陳化玉米飼糧顯著降低了肉雞的平均日采食量和料重比。本研究結(jié)果表明，陳化玉米對蛋雞的平均日采食量、料蛋比和平均蛋重沒有顯著影響，但100%陳化玉米組蛋雞的產(chǎn)蛋率顯著下降，表明陳化玉米對蛋雞的生產(chǎn)性能產(chǎn)生了負(fù)面影響。研究表明，普通玉米與陳化玉米的代謝能值無顯著差異，二者常規(guī)概略養(yǎng)分含量差異亦較小，但陳化玉米的粗蛋白質(zhì)消化率有所下降[13,21-23]。因此，蛋雞攝食陳化玉米后產(chǎn)蛋率下降的主要原因可能是玉米長期儲存后發(fā)生了脂質(zhì)過氧化與蛋白質(zhì)氧化，降低了不飽和脂肪酸和氨基酸含量以及蛋白質(zhì)可消化性，導(dǎo)致其營養(yǎng)價值降低，并可能對蛋雞造成氧化損傷，影響其健康和生產(chǎn)性能，且與陳化玉米在飼糧中的使用比例有關(guān)。

3.3 陳化玉米對蛋雞消化功能的影響

血清生化指標(biāo)可以反映機體健康和營養(yǎng)狀況。GLU含量與機體糖代謝密切相關(guān)，血清ALB含量可間接反映機體蛋白質(zhì)代謝能力。本研究發(fā)現(xiàn)，100%陳化玉米組蛋雞的血清GLU含量顯著降低。劉洋等[24]報道，飼喂儲存3年的玉米使肉雞血清GLU含量顯著降低。陳化玉米可導(dǎo)致仔豬空腸黏膜中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2的mRNA表達(dá)量下降[25]。但也有研究報道，陳化玉米顯著提高了仔豬空腸黏膜中鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白1的mRNA表達(dá)量[26]。盡管試驗動物不同，但陳化玉米在蛋雞上可能也存在相似的作用機制，從而導(dǎo)致蛋雞的血清GLU含量降低。此外，100%陳化玉米組蛋雞的血清ALB含量顯著減少，提示陳化玉米造成蛋雞蛋白質(zhì)合成和利用率減少，這可能與陳化玉米中蛋白質(zhì)氧化和氨基酸含量變化有關(guān)。

動物對各種營養(yǎng)物質(zhì)的消化均需要酶參與。Rideau等[27]指出，雞的消化酶主要在小腸中發(fā)揮作用，其活力可以反映機體消化功能和代謝狀況。本研究中，50%和100%陳化玉米組蛋雞的前腸食糜中胰蛋白酶活性均顯著降低，提示陳化玉米影響了蛋雞對蛋白質(zhì)的消化利用。王坤等[28]報道，常溫儲存可引起豆粕蛋白質(zhì)氧化，蛋雞攝入蛋白質(zhì)氧化豆粕后降低了其回腸食糜中胰蛋白酶活性。趙同芳[9]指出，谷物長期儲存后其蛋白質(zhì)的胃蛋白酶和胰蛋白酶消化率下降。蛋白質(zhì)發(fā)生氧化時，酪氨酸會發(fā)生交聯(lián)生成雙聚酪氨酸，雙聚酪氨酸具有抵抗酸水解和抑制蛋白酶活性作用[29]。此外，蛋白質(zhì)氧化使氨基酸殘基生成PC化合物、SH形成二硫鍵等都會影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致酶對其的化學(xué)和物理作用位點發(fā)生變化，降低蛋白質(zhì)水解能力，進(jìn)而降低其可消化性[30]。本試驗中，蛋雞攝食陳化玉米后前腸食糜中胰蛋白酶活性下降可能與儲存過程中陳化玉米蛋白質(zhì)發(fā)生氧化有關(guān)。

3.4 陳化玉米對蛋雞抗氧化功能的影響

脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生活性氧(ROS)，當(dāng)ROS含量超過細(xì)胞的抗氧化保護(hù)水平時會導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和內(nèi)源性脂質(zhì)破壞[31]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，PC和T-SH是反映蛋白質(zhì)氧化水平的重要指標(biāo)[17]，這些化合物含量間接表明機體氧化損傷程度。抗氧化防御系統(tǒng)控制著機體的氧化還原平衡，包括酶和非酶體系[32]?？寡趸赶到y(tǒng)是抵抗ROS損傷機體的防御系統(tǒng)，包括T-SOD、GSH-Px和CAT。GSH是非酶類抗氧化劑之一，在GSH-Px的作用下清除自由基。李錦英等[10]報道，飼喂儲存期為4年的陳化玉米顯著降低了仔豬血清GSH-Px活性和T-AOC。Qamar等[13]亦發(fā)現(xiàn)，飼喂陳化玉米飼糧肉鴨血清T-AOC及T-SOD、CAT活性顯著降低。本研究中，各陳化玉米組蛋雞血清中GSH-Px活性顯著降低，50%和100%陳化玉米組蛋雞肝臟中GSH-Px活性顯著降低，100%陳化玉米組蛋雞肝臟中CAT活性顯著降低，提示陳化玉米引起蛋雞產(chǎn)生過多的ROS，造成機體抗氧化能力下降，且與陳化玉米的替代比例有關(guān)。ROS可以誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，也可以直接攻擊蛋白質(zhì)，使其發(fā)生氧化[33]，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物也可與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，引起蛋白質(zhì)氧化。Chen等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在給肉雞腹腔注射過氧化氫建立的氧化應(yīng)激模型中，隨著胸肌中ROS和MDA含量升高，PC含量也顯著提高。Zhang等[16]報道，飼喂熱氧化大豆分離蛋白的肉雞血清MDA和PC含量上升。Liu等[12]報道，飼喂100%陳化玉米飼糧的肉雞血清MDA含量顯著升高。本研究中，50%陳化玉米組蛋雞的肝臟MDA含量顯著上升，100%陳化玉米組蛋雞的血清和肝臟MDA含量顯著升高，肝臟PC含量顯著上升，提示蛋雞攝入陳化玉米后發(fā)生了脂質(zhì)氧化，并引起蛋白質(zhì)氧化，且存在劑量效應(yīng)。這可能是因為陳化玉米中MDA含量顯著升高，ROS蓄積[35]，導(dǎo)致蛋雞攝入外源性ROS含量增加，過量的ROS超過了機體的可調(diào)節(jié)范圍，降低了蛋雞的抗氧化能力，使機體遭受氧化損傷。

3.5 陳化玉米對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

蛋品質(zhì)受許多因素影響，如品系、年齡和營養(yǎng)等[36]。盡管蛋黃顏色與營養(yǎng)價值、新鮮度或烹飪特性無關(guān)，但蛋黃顏色是消費者衡量雞蛋品質(zhì)的主要指標(biāo)之一。蛋黃顏色由蛋雞飼糧中的黃色和紅色類胡蘿卜素或葉黃素沉積到蛋黃中而形成[37]。蛋雞自身不能合成這些類胡蘿卜素和葉黃素，必須從飼糧中獲取[38]，飼糧組成以及各成分之間的比例對色素沉積具有重要影響。玉米作為蛋雞飼料的主要原料，是類胡蘿卜素和葉黃素的重要來源。本研究中，100%陳化玉米組蛋雞的蛋黃顏色顯著降低，提示蛋雞攝食陳化玉米后蛋黃中色素沉積減少，這可能與陳化玉米中葉黃素和玉米黃質(zhì)含量有關(guān)。在儲存過程中玉米中的葉黃素和玉米黃質(zhì)易被氧化而發(fā)生降解[39]，且飼糧中的多不飽和脂肪酸被氧化后可加速葉黃素和玉米黃質(zhì)的氧化而減少色素沉積[40]。因此，本研究中可能是由于儲存導(dǎo)致陳化玉米中葉黃素和玉米黃質(zhì)含量下降，進(jìn)而使攝入陳化玉米的蛋雞體內(nèi)類胡蘿卜素和葉黃素的吸收和在雞蛋中的沉積減少，從而影響了蛋黃顏色。

4 結(jié) 論

① 不同替代比例陳化玉米均使蛋雞的產(chǎn)蛋率有所降低，尤其是100%陳化玉米替代正常玉米顯著降低了蛋雞的產(chǎn)蛋率，但陳化玉米對蛋雞的平均日采食量、料蛋比和平均蛋重?zé)o顯著影響。

② 不同替代比例陳化玉米使蛋雞血清GLU和ALB含量降低，前腸消化功能下降；蛋雞血清和肝臟抗氧化功能均有不同程度下降，且100%陳化玉米替代正常玉米使蛋雞上述指標(biāo)顯著下降。

③ 不同替代比例陳化玉米不影響雞蛋的蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈夫單位和蛋黃比例，但100%陳化玉米替代正常玉米對蛋黃顏色造成一定負(fù)面影響。