黃靈杰 彭煥偉 張克英 白世平 王建萍 曾秋鳳 丁雪梅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130)

家禽養(yǎng)殖時(shí)常面臨著球蟲病、細(xì)菌病、流感及其他傳染性疾病的威脅，每年家禽養(yǎng)殖業(yè)因球蟲病就造成超過30億美元的損失[1]。而使用抗球蟲藥物面臨著藥物殘留、耐藥性、動(dòng)物福利、食品安全、環(huán)境污染等威脅[2]，且人們對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品優(yōu)質(zhì)、綠色、安全和健康等的關(guān)注度提高，因此，通過營(yíng)養(yǎng)手段進(jìn)行調(diào)控，對(duì)響應(yīng)全面禁抗的號(hào)召具有重要意義。

酸化劑具有調(diào)節(jié)機(jī)體腸道健康、增強(qiáng)免疫力和抗氧化功能，有促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)和生長(zhǎng)、抗球蟲等作用[3-4]，是理想的抗生素替代品之一。苯甲酸是一種結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單的有機(jī)酸，具有廣譜抗菌、低生物利用率等特性[5]。研究表明，苯甲酸在提高畜禽生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、改善機(jī)體健康等方面有積極的促進(jìn)作用[5]。但在球蟲攻毒條件下，苯甲酸對(duì)肉雞的作用效果不是很清楚。因此，本試驗(yàn)旨在研究球蟲攻毒條件下，苯甲酸對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和血清生化指標(biāo)、免疫功能及抗氧化能力的影響，探討苯甲酸是否可以緩解球蟲應(yīng)激帶來的不利影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腸溶型緩釋苯甲酸(enteric coated sustained-release benzoic acid，ES-B)，苯甲酸含量≥60.0%；未包被苯甲酸(uncoated benzoic acid，NC-B)，苯甲酸含量≥99.5%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)采用2×3雙因子設(shè)計(jì)，選用540只1日齡健康愛拔益加(AA)白羽肉公雞，2種攻毒處理[于14日齡時(shí)，灌服無菌生理鹽水或30倍球蟲疫苗(其球蟲卵囊數(shù)為3.3×104個(gè)/mL，含柔嫩、毒害、堆形、巨型艾美耳球蟲)1 mL]，3種苯甲酸源[飼糧中不添加苯甲酸(N-B)、添加0.05% ES-B或0.10% NC-B]，共計(jì)6個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只雞。試驗(yàn)期42 d，分1～21日齡和22～42日齡2個(gè)階段。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

試驗(yàn)采用玉米-雜粕型飼糧，參照NRC(1994)和NY/T 33—2004肉仔雞營(yíng)養(yǎng)需要并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐配制。飼糧形態(tài)為顆粒型，1～21日齡時(shí)顆粒直徑為2.0 mm，22～42日齡時(shí)顆粒直徑為3.0 mm?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表2項(xiàng)目 Items1～21日齡 1 to 21 days of age22～42日齡 22 to 42 days of ageL-鹽酸賴氨酸 L-Lys·HCl0.220.24DL-蛋氨酸 DL-Met0.220.24L-蘇氨酸 L-Thr0.020.07植酸酶 Phytase0.010.01多維 Multi-vitamin1)0.030.03礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)0.200.20合計(jì) Total100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)代謝能 ME/(MJ/kg)12.1812.64粗蛋白質(zhì) CP21.0720.00鈣 Ca0.810.81有效磷 AP0.400.41賴氨酸 Lys1.211.18蛋氨酸 Met0.530.53蘇氨酸 Thr0.800.80色氨酸 Trp0.240.23

1.4 試驗(yàn)管理

試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)肉雞均采用地面平養(yǎng)(寬1 m×長(zhǎng)2 m)，以谷殼為墊料。試驗(yàn)前清洗圈舍、料盤、料桶和飲水設(shè)備，然后用福爾馬林和高錳酸鉀(每立方米加30 mL福爾馬林和15 g高錳酸鉀)對(duì)其熏蒸48 h，開窗敞5 d后開始正式試驗(yàn)。入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃，此后溫度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃為止。采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)、自由采食和飲水。于1日齡時(shí)頸部注射馬立克+法氏囊二聯(lián)苗，8日齡時(shí)飲水免疫新城疫+傳染性支氣管炎二聯(lián)苗。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

分別于15、22和43日齡時(shí)提前12 h斷料，以重復(fù)為單位稱重，計(jì)算1～21日齡(1～14日齡、15～21日齡)、22～42日齡、1～42日齡時(shí)各重復(fù)的平均階段增重；以重復(fù)為單位計(jì)算階段體重(BW)、體增重(BWG)、平均采食量(AFI)和料重比(F/G)。

1.5.2 血清生化指標(biāo)

于22和43日齡時(shí)，稱重后從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1只接近平均體重的肉雞，頸靜脈采血10 mL，分離血清，備用。采用全自動(dòng)生化分析儀(日立3100)測(cè)定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、一氧化氮(NO)含量和乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)活性。

1.5.3 血清免疫球蛋白含量

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(購(gòu)于江蘇寶萊生物科技有限公司)測(cè)定血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量。

1.5.4 免疫器官指數(shù)

于22和43日齡時(shí)，將采血后的肉雞屠宰，取胸腺、法氏囊、脾臟，剔除表面結(jié)締組織和脂肪后稱重，根據(jù)肉雞活體重計(jì)算免疫器官指數(shù)，公式為：

免疫器官指數(shù)(%)=(免疫器官重量/
活體重)×100。

1.5.5 血清抗氧化指標(biāo)

采用ELISA試劑盒(購(gòu)于南京建成生物工程研究所試劑盒)測(cè)定血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先使用Excel 2016進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，再采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中GLM程序進(jìn)行2×3因子方差分析(ANOVA)，統(tǒng)計(jì)模型為是否球蟲攻毒、不同苯甲酸源及二者的交互作用。當(dāng)交互作用顯著時(shí)，采用Duncan氏法比較各組平均值的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有差異趨勢(shì)。所有結(jié)果均采用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

2 結(jié) 果

2.1 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，飼糧中添加苯甲酸對(duì)肉雞的BW、BWG、AFI和F/G均無顯著影響(P>0.05)；但有提高42日齡時(shí)BW和1～42日齡時(shí)BWG的趨勢(shì)(P=0.058，P=0.057)；與N-B和NC-B組相比，ES-B組的BW分別提高了3.48%和2.27%，BWG分別提高了3.54%和2.25%。球蟲攻毒顯著提高肉雞15～21日齡時(shí)的F/G(P<0.05)，顯著降低BW(除14日齡時(shí)外)、BWG和AFI(除1～14日齡時(shí)外)(P<0.05)。飼糧中添加苯甲酸與球蟲攻毒對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能無顯著交互作用(P>0.05)。

2.2 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，球蟲攻毒顯著降低肉雞21日齡時(shí)的血清ALP活性(P<0.05)，顯著提高42日齡時(shí)的血清ALB含量(P<0.05)，且有提高42日齡時(shí)血清TP含量的趨勢(shì)(P=0.055)。飼糧中添加苯甲酸有降低肉雞42日齡時(shí)血清NO含量的趨勢(shì)(P=0.068)。飼糧中添加苯甲酸與球蟲攻毒對(duì)肉雞的血清生化指標(biāo)無顯著交互作用(P>0.05)。

2.3 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，球蟲攻毒對(duì)肉雞的血清GSH-Px和T-SOD活性、T-AOC和MDA含量均無顯著影響(P>0.05)，但有降低21日齡時(shí)血清MDA含量的趨勢(shì)(P=0.071)。飼糧中添加苯甲酸顯著提高肉雞21日齡時(shí)的血清GSH-Px活性(P<0.05)，顯著降低血清MDA含量(P<0.05)，其中以NC-B組效果最佳。飼糧中添加苯甲酸與球蟲攻毒對(duì)肉雞42日齡時(shí)的血清MDA含量和GSH-Px活性有顯著交互作用(P<0.05)，表現(xiàn)為在球蟲攻毒條件下，飼糧中添加苯甲酸提高血清GSH-Px活性及降低血清MDA含量，且以NC-B組效果最佳。

2.4 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清免疫球蛋白含量的影響

由表6可知，球蟲攻毒顯著降低肉雞42日齡時(shí)的血清IgM含量(P<0.05)。飼糧中添加NC-B顯著提高肉雞21日齡時(shí)的血清IgM含量和42日齡時(shí)的血清IgA含量(P<0.05)。飼糧中添加苯甲酸與球蟲攻毒對(duì)肉雞21日齡時(shí)的血清IgM含量有顯著交互作用(P<0.05)，表現(xiàn)為在球蟲攻毒條件下，飼糧中添加苯甲酸提高血清IgM含量，且以ES-B組效果最佳。

2.5 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表7可知，球蟲攻毒對(duì)肉雞42日齡時(shí)的胸腺指數(shù)有降低趨勢(shì)(P=0.064)。飼糧中添加苯甲酸顯著提高肉雞21日齡時(shí)的胸腺指數(shù)(P<0.05)。飼糧中添加苯甲酸與球蟲攻毒對(duì)肉雞的免疫器官指數(shù)無顯著交互作用(P>0.05)。

3 討 論

3.1 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞生長(zhǎng)性能的影響

在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，存在著病原菌侵害機(jī)體的可能，其會(huì)降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能及機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，從而帶來一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于苯甲酸在肉雞壞死性腸炎如球蟲、沙門氏菌等上的研究較少，其中對(duì)球蟲的研究主要集中在丁酸鹽及其鹽類[3-4,6-7]對(duì)肉雞的影響。Yan等[8]在飼糧中添加500 g/t包被苯甲酸，于14日齡時(shí)灌服10倍雞球蟲疫苗，結(jié)果表明球蟲攻毒降低了肉雞的生長(zhǎng)性能，添加包被苯甲酸提高了球蟲攻毒組的生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)中，球蟲攻毒降低了肉雞的生長(zhǎng)性能，同時(shí)在飼糧中添加苯甲酸對(duì)42日齡時(shí)的BW和1～42日齡時(shí)的BWG有提高趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果基本一致。盡管本試驗(yàn)球蟲攻毒后在飼糧中添加苯甲酸對(duì)肉雞的生長(zhǎng)性能沒有顯著的改善作用，但與未攻毒組相比，N-B、ES-B和NC-B攻毒組21日齡時(shí)的BW分別降低了7.83%、6.81%和3.78%，42日齡時(shí)的BW分別降低了5.82%、4.48%和2.53%；說明在球蟲攻毒條件下，飼糧中添加苯甲酸對(duì)球蟲攻毒造成的生長(zhǎng)性能下降有一定的緩解效果，且ES-B的緩解效果最佳，其原因可能是ES-B經(jīng)包被處理，可持續(xù)在腸道定點(diǎn)緩慢釋放，改善腸道健康，緩解球蟲攻毒導(dǎo)致的生長(zhǎng)性能下降。

表3 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞生長(zhǎng)性能的影響

表4 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清生化指標(biāo)的影響

表5 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

表6 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清免疫球蛋白含量的影響

表7 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞免疫器官指數(shù)的影響

血清生化指標(biāo)可間接反映機(jī)體的健康狀態(tài)和生長(zhǎng)性能。代長(zhǎng)云等[9]研究表明，飼糧中添加苯甲酸降低了肉兔的血清ALP活性。茍清碧等[10]研究表明，飼糧中添加包埋苯甲酸提高了青麻腳雞的血清球蛋白、TP和ALP含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加苯甲酸對(duì)肉雞的血清生化指標(biāo)無顯著影響，其原因可能是試驗(yàn)動(dòng)物、飼糧營(yíng)養(yǎng)水平及苯甲酸添加劑量的不同；但添加苯甲酸有降低42日齡時(shí)血清NO含量的趨勢(shì)。NO是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種新型免疫調(diào)節(jié)因子和炎癥遞質(zhì)，可通過介導(dǎo)內(nèi)毒素等細(xì)胞因子，對(duì)多種原蟲(球蟲、弓形蟲等)起到抑殺作用，且球蟲攻毒后體內(nèi)的NO含量升高[11]。郭紅斌等[12]研究表明，機(jī)體血清NO含量下降可以緩解應(yīng)激因素對(duì)肉雞帶來的一系列損傷。有關(guān)球蟲攻毒對(duì)雞血清生化指標(biāo)影響的報(bào)道結(jié)果不盡相同。Kogut等[13]研究發(fā)現(xiàn)，球蟲攻毒7 d后，肉雞的血清ALP活性顯著降低。葛凱[14]研究表明，球蟲攻毒后第5天和第9天，雞的血清ALP活性顯著升高。李建梅等[15]研究表明，在肉雞26日齡時(shí)球蟲攻毒，攻毒后第6天血清的ALB和TP含量顯著降低。本試驗(yàn)中，球蟲攻毒顯著降低了肉雞21日齡時(shí)的血清ALP活性，顯著提高了42日齡時(shí)的血清ALB含量；前者降低的原因可能是血液中的ALP因球蟲攻毒導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞損傷而被釋放到腸腔中，最終導(dǎo)致ALP流失，后者升高的原因一方面可能與飼糧配方組成、球蟲攻毒時(shí)間及球蟲種類等有關(guān)，另一方面可能是雞只感染球蟲后呈病理狀態(tài)，造成體液損失而導(dǎo)致血清ALB含量顯著升高。此外，本試驗(yàn)中，球蟲攻毒有提高42日齡時(shí)肉雞血清TP含量的趨勢(shì)，結(jié)果與前人研究存在差異，原因可能是本試驗(yàn)用30倍球蟲攻毒，在應(yīng)激條件下促進(jìn)了肌肉中蛋白質(zhì)和體脂的分解，為糖元異生提供了原料，使血清TP含量升高。

3.2 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞血清抗氧化能力的影響

Papadomichelakis等[16]研究表明，飼糧中添加苯甲酸提高了育肥兔紅細(xì)胞的GSH-Px活性。Diao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.5%苯甲酸降低了仔豬的血清MDA含量。本試驗(yàn)中，飼糧中添加苯甲酸顯著提高了肉雞21日齡時(shí)的血清GSH-Px活性，顯著降低了血清MDA含量，與前人的研究結(jié)果相似。常翠青等[18]研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸含有的羧基能夠清除機(jī)體內(nèi)自由基，中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制脂質(zhì)過氧化，從而緩解氧化損傷。

當(dāng)動(dòng)物機(jī)體處于應(yīng)激或疾病時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生氧化損傷；當(dāng)機(jī)體被病原菌攻毒時(shí)，會(huì)使機(jī)體的抗氧化能力下降。郭兵等[19]研究發(fā)現(xiàn)，艾美耳球蟲攻毒后，雛雞的血清T-SOD和GSH-Px活性顯著降低。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，球蟲攻毒對(duì)肉雞的血清抗氧化能力無顯著影響，這與前人的研究結(jié)果不一致，可能與攻毒所用的球蟲種類、攻毒劑量以及攻毒時(shí)間不同有關(guān)；同時(shí)在飼糧中添加苯甲酸顯著提高了42日齡時(shí)的血清GSH-Px活性，顯著降低了42日齡時(shí)的血清MDA含量，且以NC-B的效果最佳，其原因可能是血清GSH-Px活性增加，對(duì)球蟲攻毒應(yīng)激造成了一種補(bǔ)償機(jī)制，從而降低了血清MDA含量。這表明苯甲酸能在一定程度上提高球蟲攻毒肉雞機(jī)體的抗氧化能力，維系機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)平衡。

3.3 苯甲酸對(duì)球蟲攻毒肉雞免疫功能的影響

免疫功能在維護(hù)動(dòng)物腸道健康和機(jī)體健康上有著重要作用。研究表明，動(dòng)物機(jī)體的免疫水平可隨著免疫器官相對(duì)重量的增加而提高[20]。動(dòng)物機(jī)體的免疫器官指數(shù)、血清免疫和腸道免疫等都可反映動(dòng)物機(jī)體代謝和健康狀態(tài)。許金根等[21]研究表明，飼料中添加酸化劑有提高肉雞胸腺和法氏囊指數(shù)的趨勢(shì)，提高了機(jī)體免疫力。陳佳力[22]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2 000 mg/kg苯甲酸顯著提高了仔豬的血清IgG和IgM含量。本試驗(yàn)中，飼糧中添加苯甲酸顯著提高了肉雞42日齡時(shí)的血清IgA含量、21日齡時(shí)的血清IgM含量和胸腺指數(shù)，與前人研究結(jié)果類似，說明苯甲酸可促進(jìn)肉雞機(jī)體免疫水平的提高；其中，胸腺指數(shù)和血清免疫球蛋白含量的增加，表明苯甲酸促進(jìn)了前期免疫器官的發(fā)育，對(duì)提高肉雞前期免疫水平有一定的作用。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體處于免疫應(yīng)激時(shí)，機(jī)體的免疫器官會(huì)因?yàn)樽陨頎I(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足而發(fā)生萎縮[23]，球蟲攻毒會(huì)阻礙免疫器官的發(fā)育[24]。薛敬潔等[25]報(bào)道認(rèn)為，羅曼公雛27日齡時(shí)球蟲攻毒1×105個(gè)孢子化球蟲卵囊，降低了血清IgA、IgG和IgM含量。本試驗(yàn)中，球蟲攻毒降低了肉雞42日齡時(shí)的血清IgM含量和胸腺指數(shù)，與前人研究結(jié)果相似；同時(shí)在飼糧中添加苯甲酸提高了21日齡時(shí)的血清IgM含量，表明飼糧中添加苯甲酸可能對(duì)球蟲攻毒導(dǎo)致的免疫功能降低有一定程度的緩解作用，一方面通過提高了機(jī)體免疫球蛋白含量和胸腺指數(shù)，另一方面通過降低血清NO含量，2方面協(xié)同作用增強(qiáng)機(jī)體的抗體活性，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)球蟲等致病菌的抵抗力。研究表明，血清IgA、IgG和IgM含量的提高可在一定程度上減緩機(jī)體腸道疾病的發(fā)生[26]。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加苯甲酸可通過提高肉雞的血清抗氧化能力、免疫球蛋白含量，從而對(duì)球蟲攻毒造成的生長(zhǎng)性能降低有一定的緩解效果，且添加0.05% ES-B緩解效果較好。