吳宇梁 彭長鳳 崔志娟 熊 霞 肖定福 李 彪 印遇龍*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，長沙410128；2.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點實驗室，長沙410125；3.安琪酵母股份有限公司，宜昌443000)

為了提高畜禽的生長速度和飼料利用效率，降低發(fā)病率和死亡率，抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[1]。然而，抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生且在動物體內(nèi)大量殘留，同時過量的抗生素通過糞尿途徑排出畜體，對生態(tài)環(huán)境造成了污染，破壞了生態(tài)平衡[2]。隨著除中草藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑的全面禁用，尋找安全綠色的抗生素替代品成為亟待解決的問題。

研究表明，添加酵母多糖可吸附飼糧中的霉菌毒素，緩解仔豬的斷奶應(yīng)激，增強免疫調(diào)節(jié)功能，改善生長性能[3-4]?；瘜W成分分析顯示，甘露寡糖約占酵母細胞壁干重的30%，β-葡聚糖約占30%，糖蛋白和幾丁質(zhì)約占20%，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、無機鹽和其他組分約占20%[5]。報道認為，飼糧中添加甘露聚糖可提高保育豬的生長性能，促進斷奶仔豬從先天性免疫反應(yīng)向適應(yīng)性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變[6]。酵母細胞壁中的β-葡聚糖可作為免疫活性物質(zhì)，通過刺激免疫細胞發(fā)揮免疫刺激作用，從而抵抗致病菌的入侵，提高動物的生產(chǎn)性能[7]。

目前研究所用的酵母多糖大都是采用全破碎酵母細胞壁技術(shù)，通過抽提的方法直接離心干燥制成的[8]。而本試驗所使用的酵母多糖是通過酶解破壁后進一步加復(fù)合酶處理，再離心干燥而制成的[9]?；罨慕湍讣毎冢捎诿附馓幚?，外層甘露聚糖酶解成甘露寡糖溶于水，內(nèi)層葡聚糖表面功能性位點暴露更充分，更易發(fā)揮其生物學功能。因此，本研究旨在評估飼糧中添加活化酵母多糖(以下簡稱酵母多糖)對21日齡斷奶仔豬生長性能、腸道形態(tài)、抗氧化能力和腸道免疫狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

本試驗使用的試驗設(shè)計和程序已獲得中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所動物護理和使用委員會的批準。

1.1 試驗材料

酵母多糖(含20%甘露寡糖、35% β-葡聚糖、45%蛋白質(zhì))為宜昌某股份有限公司提供，吉他霉素和硫酸黏菌素購于上海某生物科技有限公司。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選取體重[(6.89±0.88) kg]相近、健康狀況良好的21日齡長×大×杜雜交閹公斷奶仔豬32頭，隨機分為4個組，每組8個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%酵母多糖(0.1%酵母多糖組)、0.2%酵母多糖(0.2%酵母多糖組)、55 mg/kg吉他霉素和20 mg/kg硫酸黏菌素(抗生素組)的試驗飼糧?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)和《豬飼養(yǎng)標準》(NY/T 65—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。預(yù)試期3 d，正試期28 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物房進行，全封閉式豬舍，漏縫金屬材質(zhì)地面，不銹鋼可調(diào)式料槽，乳頭式飲水器。仔豬單籠飼養(yǎng)，并按照豬場標準飼養(yǎng)管理程序?qū)ψ胸i進行驅(qū)蟲和免疫處理。自由飲水和采食，粉料飼喂。整個圈舍采取自然通風，保持清潔，在試驗期內(nèi)對所在圈舍進行不定期消毒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1.4 樣品采集與指標測定

1.4.1 生長性能和器官指數(shù)測定

觀察并記錄仔豬每天的采食量，淘汰或死亡仔豬及時稱重并記錄。試驗第1天和第29天早晨對每頭仔豬稱重并做記錄，稱重前空腹12 h，計算平均日增重、平均日采食量及料重比。試驗結(jié)束時，對所有仔豬肌注4%戊巴比妥鈉溶液進行麻醉。待麻醉完全后，頸靜脈放血處死，再進行屠宰解剖，取出肝臟和脾臟，吸干表面水分后進行稱重。器官指數(shù)按以下公式計算：

器官指數(shù)(g/kg)=器官鮮重(g)/
仔豬活體重(kg)。

1.4.2 腹瀉指數(shù)測定

試驗前9 d，每天早晚各1次由同一個人觀察并記錄各組仔豬的腹瀉程度(0分：正常成形；1分：軟糞，能成形；2分：稠狀，不成形，糞水無分離；3分：液狀，不成形，糞水分離)和腹瀉頭數(shù)，并計算腹瀉率及腹瀉指數(shù)。

腹瀉率(%)=[腹瀉次數(shù)/
(試驗仔豬頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100；
腹瀉指數(shù)=(糞便評分之和)/試驗仔豬頭數(shù)。

1.4.3 樣品采集

待仔豬屠宰后，收集十二指腸近端、空腸中端和回腸后端，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉其中的內(nèi)容物，將其分為2份，其中一份(1～2 cm)用4%的甲醛磷酸鹽緩沖液固定，以便在顯微鏡下觀察腸道形態(tài)；另一份用于收集黏膜，刮好后的小腸黏膜在液氮中快速冷凍，收集后的黏膜組織樣品保存在-80 ℃用于進一步分析。同時，在十二指腸近端、空腸中端、回腸后端、盲腸和結(jié)腸區(qū)域收集食糜樣品，并測量其pH。

1.4.4 腸道形態(tài)分析

使用梯度酒精對固定后的十二指腸、空腸和回腸組織(約0.5 cm)進行脫水，通過二甲苯處理使其透明，隨后用石蠟進行包埋，最后將樣品切成5 μm厚度的切片，用乙醇脫蠟處理后用蘇木精-伊紅(HE)染色。使用圖像處理和分析系統(tǒng)(Version 1; Leica Imaging Systems Ltd., Cambridge, UK)在顯微鏡下以40倍的放大倍數(shù)測量染色切片上的絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度。在完整的腸絨毛上計數(shù)100個腸上皮細胞中上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)和杯狀細胞(GC)的數(shù)目，每個切片重復(fù)計數(shù)5次。

1.4.5 抗氧化能力分析

采用多功能酶標儀(TECAN公司)檢測腸黏膜組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性及谷胱甘肽(GSH)的含量，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.6 細胞因子RT-PCR分析

稱取0.1 g左右小腸黏膜組織樣品，使用Trizol提取組織中的總RNA，然后用紫外分光光度計測定RNA濃度。取1 ng上述RNA作為模板，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連)合成第1鏈cDNA。根據(jù)GenBank中豬的白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-12(IL-12)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因及內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)序列，依據(jù)引物設(shè)計原則，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物，見表2。設(shè)計完成后將引物序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物的合成。然后以cDNA作為模板，采用試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)，使用ABI7900HT-PCR儀器(ABI Biotechnology，美國)對樣品進行擴增，并運用配套軟件(Applied Biosystem，SDS2.3)進行數(shù)據(jù)分析。以GAPDH為內(nèi)參基因，對獲得的信號、數(shù)據(jù)進行處理，采用2-ΔΔCt法對定量結(jié)果進行計算分析。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法進行多重比較檢驗，結(jié)果以平均值和均值標準誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著差異趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 酵母多糖對斷奶仔豬生長性能、器官指數(shù)、腹瀉指數(shù)和腸道pH的影響

由表3可知，各組斷奶仔豬的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，飼糧中添加0.1%酵母多糖和抗生素可顯著增加斷奶仔豬的平均日增重(P<0.05)，0.1%、0.2%酵母多糖和抗生素組顯著降低料重比(P<0.05)；與其他3組相比，飼糧中添加0.1%酵母多糖可顯著增加平均日采食量(P<0.05)。與對照組相比，0.1%、0.2%酵母多糖和抗生素組可降低斷奶仔豬的腹瀉率和腹瀉指數(shù)，但無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，飼糧中添加0.1%酵母多糖可顯著降低斷奶仔豬的盲腸內(nèi)容物pH(P<0.05)；各組的十二指腸、空腸和結(jié)腸內(nèi)容物pH之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 用于RT-PCR分析的引物序列

表3 酵母多糖對斷奶仔豬生長性能、器官指數(shù)、腹瀉指數(shù)和腸道pH的影響

2.2 酵母多糖對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加0.1%和0.2%酵母多糖有增加斷奶仔豬空腸絨毛高度的趨勢(0.050.05)。與其他3組相比，飼糧中添加0.1%酵母多糖有增加斷奶仔豬十二指腸絨毛高度/隱窩深度的趨勢(0.05

表4 酵母多糖對斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

2.3 酵母多糖對斷奶仔豬腸道黏膜抗氧化能力的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加0.2%酵母多糖和抗生素可顯著降低斷奶仔豬的十二指腸黏膜SOD活性(P<0.05)；飼糧中添加0.1%、0.2%酵母多糖和抗生素可顯著降低空腸黏膜SOD活性(P<0.05)；飼糧中添加0.1%酵母多糖和抗生素有降低回腸黏膜SOD活性的趨勢(0.050.05)。

2.4 酵母多糖對斷奶仔豬腸道黏膜細胞因子mRNA表達的影響

由表6可知，與對照組相比，0.2%酵母多糖組斷奶仔豬的十二指腸黏膜IL-6的mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。與抗生素組相比，0.1%和0.2%酵母多糖組斷奶仔豬的十二指腸黏膜IL-12的mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。與對照組相比，0.1%、0.2%酵母多糖和抗生素組斷奶仔豬的空腸黏膜TNF-α的mRNA表達量有降低趨勢(0.05

3 討 論

斷奶應(yīng)激是豬整個生產(chǎn)周期中最大的應(yīng)激之一，因為仔豬不僅遭受營養(yǎng)供給從富含蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖的高效率母乳轉(zhuǎn)變?yōu)橄瘦^低的以淀粉為基礎(chǔ)的固體飼糧的轉(zhuǎn)變，而且必須迅速適應(yīng)心理和社會環(huán)境的急劇變化[10]，斷奶極易導(dǎo)致仔豬的早期斷奶綜合征[11]。而源自于酵母細胞壁的甘露寡糖和葡聚糖被視為改善動物生長性能和健康狀況的益生元[12]。已有研究表明，飼糧中添加酵母多糖可減少仔豬腹瀉，改善斷奶后仔豬的生長性能[13]。而徐杰等[14]研究表明，飼糧中添加酵母細胞壁多糖不能改善斷奶仔豬的生長性能。本試驗中，與對照組相比，飼喂添加0.1%酵母多糖的飼糧可顯著提高斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量；飼糧中添加0.1%和0.2%酵母多糖可降低腹瀉率和腹瀉指數(shù)，但無顯著差異；飼糧中添加0.1%、0.2%酵母多糖和抗生素改善了料重比。這些結(jié)果的差異可能與酵母多糖的濃度、純度、分子質(zhì)量、添加水平、構(gòu)像、化學結(jié)構(gòu)以及活化程度有關(guān)。本試驗結(jié)果表明，酵母多糖可通過提高采食量來改善斷奶仔豬的生長性能。

表5 酵母多糖對斷奶仔豬腸道黏膜抗氧化指標的影響

表6 酵母多糖對斷奶仔豬腸道黏膜IL-6、TNF-α、IL-12和IL-10的mRNA表達量的影響

仔豬的腸道酸度是影響消化吸收功能的重要因素，也是調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境pH平衡和電解質(zhì)平衡的基本條件[15]。本試驗中，飼喂含0.1%酵母多糖飼糧的斷奶仔豬，其盲腸內(nèi)容物pH較對照組低。盲腸是微生物發(fā)酵的主要區(qū)域，益生菌會通過非消化性多糖的發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，降低盲腸pH。酵母多糖會抑制腸道中某些致病菌(如大腸桿菌和沙門氏菌)的定植，同時促進益生菌(如乳酸桿菌和雙歧桿菌)的定植。本試驗中，飼喂含0.1%酵母多糖飼糧的斷奶仔豬盲腸內(nèi)容物pH低于對照組，這可能是因為酵母多糖在大腸中通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的揮發(fā)性脂肪酸。0.1%酵母多糖組生長性能的改善可能有部分原因是由于盲腸中pH的降低。

絨毛是小腸的特殊結(jié)構(gòu)，其高度和密度直接影響小腸的吸收面積。絨毛高度和密度的增加會擴大小腸的吸收區(qū)域，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。絨毛高度/隱窩深度是衡量仔豬小腸功能和健康的重要指標[16]。報道認為，飼糧中添加酵母甘露寡糖可顯著提高豬的空腸絨毛高度[17]。本試驗中，飼糧中添加0.1%酵母多糖有增加空腸絨毛高度和十二指腸絨毛高度/隱窩深度的趨勢，這與添加0.1%酵母多糖改善仔豬生長性能的結(jié)果相一致。由杯狀細胞和腸上皮內(nèi)淋巴細胞等組成的腸上皮細胞是仔豬抵御毒素和外源病原體的第1道屏障，杯狀細胞可通過分泌黏蛋白來抵御腸腔內(nèi)的有害成分[18]。上皮內(nèi)淋巴細胞構(gòu)成腸道中第1個防御性免疫細胞系，并在調(diào)節(jié)上皮細胞的完整性、黏膜免疫和外源抗原的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加0.2%酵母多糖可增加斷奶仔豬的空腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量；添加0.1%酵母多糖可顯著增加回腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量。這些結(jié)果表明酵母多糖可維持斷奶仔豬的腸道完整性。

氧化應(yīng)激是指細胞中氧化和抗氧化作用失衡，并抑制抗氧化酶的活性，其中GSH和SOD是氧自由基的清除劑。研究表明，在母豬飼糧中添加酵母甘露寡糖可顯著增加后代仔豬的SOD和過氧化氫酶活性[19]。本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加0.1%和0.2%酵母多糖可顯著降低斷奶仔豬的空腸黏膜SOD活性。這可能是因為酵母多糖的免疫刺激活性和病原體的有效清除力減少了自由基的產(chǎn)生[20]，并因此減少了GSH和SOD的產(chǎn)生。

細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞合成和分泌的一類具有廣泛生物活性的蛋白質(zhì)，在細胞間充當信號分子，主要調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與免疫細胞分化，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21]。單核吞噬細胞、淋巴細胞和Th1細胞可產(chǎn)生IL-6、TNF-α和IL-12等促炎細胞因子，參與炎癥反應(yīng)，以防御如細菌和病毒在內(nèi)的病原微生物[22]。然而，促炎因子的過度表達可能對動物體造成病理損害，抑制動物的生長性能并降低生產(chǎn)效率[23]。IL-10是限制免疫反應(yīng)中組織損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，具有很強的免疫抑制和抗炎作用[24]。甘露寡糖和β-葡聚糖都可作為免疫調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生并增強機體的免疫功能。報道認為，飼糧中添加酵母甘露寡糖可能促進抗炎因子(如IL-10)的分泌，從而減輕過度性免疫反應(yīng)和免疫應(yīng)激[25]。Li等[26]研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-葡聚糖可顯著降低仔豬的血清IL-6和TNF-α含量，增加血清IL-10含量。本試驗中，與對照組相比，飼糧中添加0.2%酵母多糖可顯著降低斷奶仔豬的十二指腸黏膜促炎因子IL-6的mRNA表達量，顯著提高回腸黏膜抗炎因子IL-10的mRNA表達量。這些結(jié)果表明，酵母多糖可能通過調(diào)節(jié)腸道黏膜細胞因子的產(chǎn)生來影響斷奶仔豬的腸道免疫功能。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼糧中添加0.1%和0.2%酵母多糖可提高斷奶仔豬的生長性能，降低盲腸pH，改善腸道形態(tài)并降低腸道炎癥。在本試驗條件下，仔豬飼糧中酵母多糖的適宜添加水平為0.1%。