溫曉鹿 鄭春田 楊雪芬 蔣宗勇 高開國 張 潔 王 麗*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州510640；2.清遠(yuǎn)市龍發(fā)種豬有限公司，廣東省種豬育種工程技術(shù)研究中心，清遠(yuǎn)513058)

仔豬斷奶后由于消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，引起仔豬斷奶應(yīng)激綜合征，主要表現(xiàn)為仔豬腹瀉率增加、生長性能下降等[1-2]。生產(chǎn)上主要在飼糧中添加抗生素來抑制有害微生物的生長，控制仔豬腹瀉，提高生產(chǎn)效益[3]。然而自2020年7月1日起，我國全面停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼糧[4]，這使得我國仔豬健康養(yǎng)殖面臨重大挑戰(zhàn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸是一種有效的抗生素替代產(chǎn)品[5-6]。苯甲酸是最簡單的芳香酸，屬于有機(jī)酸的一種。苯甲酸具有降低飼糧系酸力、抑制腸道有害菌繁殖、促進(jìn)飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)消化、提高腸道消化酶活性等多種生物學(xué)作用[7-8]。但是，目前苯甲酸的研究主要針對24[7,9]、28[10-11]、38日齡[12]斷奶仔豬，而我國商業(yè)豬場普遍在21日齡斷奶，所以有必要進(jìn)一步系統(tǒng)地研究其在21日齡斷奶仔豬上的應(yīng)用情況。因此，本試驗以21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬為試驗動物，旨在研究飼糧中添加苯甲酸對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率和腸道菌群的影響，為苯甲酸的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用苯甲酸純度為99.5%。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選取21日齡“杜×長×大”斷奶仔豬72頭，隨機(jī)分為對照組(基礎(chǔ)飼糧)和苯甲酸組(基礎(chǔ)飼糧+5 000 mg/kg苯甲酸)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬(公母各占1/2)。試驗期42 d，分為3個階段：第1～14天、第15～28天、第29～42天?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，營養(yǎng)水平參照《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004)中3～8 kg、8～20 kg仔豬營養(yǎng)需要量，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。各組飼糧營養(yǎng)水平一致，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，苯甲酸組在基礎(chǔ)飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items第1～14天Days 1 to 14第15～42天Days 15 to 42賴氨酸 Lys1.501.25蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.800.66蘇氨酸 Thr0.860.74色氨酸 Trp0.250.21鈣 Ca0.850.75總磷 TP0.650.56有效磷 AP0.490.37

1.3 飼養(yǎng)管理及樣品采集

試驗動物每天分別于08:00與16:00投料，共飼喂2次，試驗期間仔豬自由采食、飲水。在第15和43天早上稱完重后，每個重復(fù)選取1頭與平均體重相近的仔豬，頸靜脈注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)溶液麻醉屠宰。采集回腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物放于2 mL的離心管并轉(zhuǎn)移到液氮迅速冷凍，之后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 生長性能

試驗期間準(zhǔn)確記錄每天每欄采食量，并分別在仔豬斷奶后第1、15、29、43天早上對仔豬進(jìn)行空腹稱重，計算仔豬斷奶后第1～14天、第15～28天、第29～42天、第1～28天、第1～42天平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 腹瀉評分

腹瀉率：每天早上和下午喂料前，觀察仔豬糞便，參照Wen等[13]方法對仔豬糞便進(jìn)行評分，2、3分記為腹瀉。糞便評分標(biāo)準(zhǔn)見表2，以欄為單位統(tǒng)計仔豬腹瀉率。

腹瀉率(%)=∑[(仔豬腹瀉天數(shù)×腹瀉仔豬
頭數(shù))/(試驗仔豬總頭數(shù)×
正試期天數(shù))]×100。

表2 糞便評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 腸道內(nèi)容物微生物組成

將提取的總細(xì)菌DNA分別和不同濃度總細(xì)菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量PCR檢測，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度和Ct值做回歸分析，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣品Ct值帶入回歸方程計算得到目標(biāo)菌屬DNA拷貝數(shù)，結(jié)果用每克內(nèi)容物中細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)表示(lg拷貝數(shù)/g)。PCR所用引物見表3。

表3 細(xì)菌的特異性引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，采用軟件SPSS 19的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行2組間試驗數(shù)據(jù)分析，0.05≤P<0.10時為有顯著趨勢，P<0.05時為差異顯著，P<0.01時為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯甲酸對斷奶仔豬生長性能的影響

由表4可知，與對照組相比，斷奶仔豬飼糧中添加苯甲酸顯著提高仔豬斷奶后第15天的體重(P<0.05)，顯著提高仔豬斷奶后第1～14天平均日增重(P<0.05)，顯著降低仔豬斷奶后第29～42天、第1～42天料重比(P<0.05)，有降低仔豬斷奶后第1～14天料重比的趨勢(P=0.076)。與對照組相比，苯甲酸組平均日增重全期提高11.1%(P>0.05)，平均日采食量全期提高7.6%(P>0.05)。

2.2 苯甲酸對斷奶仔豬腹瀉率和糞便評分的影響

由表5可知，與對照組相比，斷奶仔豬飼糧中添加苯甲酸，顯著降低仔豬斷奶后第1～14天、第15～28天、第29～42天、第1～42天的腹瀉率(P<0.05)；顯著降低仔豬斷奶后第1～14天、第15～28天、第29～42天、第1～28天、第1～42天的糞便評分(P<0.05)。

表4 飼糧中添加苯甲酸對斷奶仔豬生長性能的影響

表5 飼糧中添加苯甲酸對斷奶仔豬腹瀉率和糞便評分的影響

續(xù)表5項目Items對照組Control group苯甲酸組Benzoic acid groupSEMP值P-value第1～28天 Days 1 to 28腹瀉率 Diarrhea frequency/%8.7904.365 2.2170.074糞便評分 Fecal score0.553a0.328b0.0730.011第1～42天 Days 1 to 42腹瀉率 Diarrhea frequency/%7.526a3.466b1.7350.043糞便評分 Fecal score0.465a0.284b0.0520.006

2.3 苯甲酸對斷奶仔豬腸道微生物組成的影響

由表6可知，與對照組相比，斷奶仔豬飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著降低仔豬斷奶后第14天回腸、盲腸、結(jié)腸芽孢桿菌的數(shù)量(P<0.05)，顯著降低仔豬斷奶后第42天盲腸芽孢桿菌的數(shù)量(P<0.05)；顯著降低仔豬斷奶后第14天結(jié)腸、第42天盲腸和結(jié)腸總細(xì)菌的數(shù)量(P<0.05)；顯著增加仔豬斷奶后第42天回腸乳酸桿菌的數(shù)量(P<0.05)，顯著降低仔豬斷奶后第14天回腸雙歧桿菌的數(shù)量(P<0.05)，有增加仔豬斷奶后第14天回腸乳酸桿菌數(shù)量的趨勢(P=0.083)，有降低仔豬斷奶后第42天結(jié)腸大腸桿菌數(shù)量的趨勢(P=0.065)。

表6 飼糧中苯甲酸對斷奶仔豬腸道微生物組成的影響

續(xù)表6項目Item對照組Control group苯甲酸組Benzoic acid groupSEMP值P-value雙歧桿菌 Bifidobacterium7.276.950.2450.216芽孢桿菌 Bacillus4.985.270.3010.362總細(xì)菌 Total bacteria11.3011.470.1640.327盲腸 Caecum大腸桿菌 Escherichia coli7.056.820.3000.475乳酸桿菌 Lactobacillus9.629.790.4130.676雙歧桿菌 Bifidobacterium9.979.760.1230.110芽孢桿菌 Bacillus7.58a7.02b0.1690.008總細(xì)菌 Total bacteria13.14a12.81b0.1160.019結(jié)腸 Colon大腸桿菌 Escherichia coli6.836.100.3510.065乳酸桿菌 Lactobacillus9.839.540.3190.383雙歧桿菌 Bifidobacterium9.789.850.8550.392芽孢桿菌 Bacillus7.076.900.1210.169總細(xì)菌 Total bacteria12.61a12.36b0.5630.001

3 討 論

3.1 苯甲酸對斷奶仔豬生長性能的影響

苯甲酸又稱安息香酸，是羧基直接與苯環(huán)碳原子相連接的最簡單的芳香酸，其酸性較弱，屬于弱有機(jī)酸。隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼用抗生素的禁用，目前普遍認(rèn)為酸化劑可作為有效的抗生素替代產(chǎn)品。有機(jī)酸促進(jìn)仔豬生長的研究比較多，但苯甲酸作為酸化劑在仔豬上的研究還比較少。Torrallardona等[15]和舒燕[10]研究均發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著提高斷奶仔豬的平均日增重、平均日采食量，顯著降低料重比。Gutzwiller等[16]也報道，飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著改善仔豬的平均日增重和平均日采食量，對仔豬的料重比無顯著影響，其他研究[17-18]也有類似結(jié)果。本研究表明，飼糧中添加苯甲酸顯著提高仔豬斷奶后第15天的體重，顯著提高仔豬斷奶后第1～14天平均日增重，顯著降低仔豬斷奶后第29～42天、第1～42天料重比。但是也存在一些不一致的結(jié)果。刁慧[7]研究報道，飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸對斷奶仔豬的平均日增重和平均日采食量沒有顯著影響。蔡瑞芳等[19]在斷奶仔豬飼糧中添加5 000和10 000 mg/kg苯甲酸對斷奶仔豬平均日增重、平均日采食量和料重比無顯著影響。飼糧中添加苯甲酸提高仔豬生長性能可能是由于苯甲酸能有效抑制有害微生物的生長，改善仔豬的腸道形態(tài)[20]，提高飼料消化率。Guggenbuhl等[21]報道，飼糧中添加苯甲酸顯著提高仔豬粗蛋白質(zhì)和能量的表觀消化率。苯甲酸作為酸化劑，能夠有效抑制飼糧的霉變，改善飼糧的適口性，提高仔豬的采食量。不同的試驗結(jié)果說明苯甲酸在不同的飼養(yǎng)條件下試驗結(jié)果存在差異，試驗飼糧的組成、試驗動物的健康狀況及試驗場環(huán)境均會影響試驗結(jié)果。

3.2 苯甲酸對斷奶仔豬腹瀉率和糞便評分的影響

仔豬斷奶后，腹瀉是影響仔豬生長性能的主要因素。研究報道，飼糧中添加苯甲酸顯著降低仔豬的腹瀉指數(shù)[22]。李潔云等[12]研究苯甲酸與酶制劑、植物精油、益生菌的聯(lián)合使用效果，結(jié)果表明其替代抗生素能顯著提高仔豬的平均日增重，降低仔豬腹瀉。李璐等[11]報道，飼糧中添加苯甲酸和葡萄糖氧化酶顯著降低仔豬腸道中大腸桿菌的數(shù)量和腹瀉率。其他研究也發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌攻毒的條件，飼糧中添加3 000 mg/kg的苯甲酸、400 mg/kg凝結(jié)芽孢桿菌和400 mg/kg的牛至油顯著降低仔豬的腹瀉率和腹瀉指數(shù)[9]。本研究表明，飼糧中添加苯甲酸顯著降低仔豬斷奶后的腹瀉率和糞便評分,這與其他研究結(jié)果一致。斷奶仔豬腹瀉的原因主要是由于生活環(huán)境、飼糧類型的改變，破壞腸道微生態(tài)平衡，導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，引起仔豬腹瀉率增加[1]。苯甲酸控制仔豬腹瀉的機(jī)理主要是通過降低飼糧的pH和緩沖能力，從而降低腸道內(nèi)容物的酸度[23]；抑制大腸桿菌等有害微生物的生長，維持腸道微生態(tài)平衡從而減少腹瀉[8]。本研究也發(fā)現(xiàn)飼糧中添加苯甲酸有降低腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量的趨勢。

3.3 苯甲酸對斷奶仔豬腸道微生物組成的影響

健康仔豬腸道中有害菌和有益菌處在一個動態(tài)平衡狀態(tài)，斷奶應(yīng)激會導(dǎo)致仔豬腸道微生態(tài)失衡，引起仔豬腹瀉，其主要原因是乳酸桿菌等有益菌數(shù)量降低，大腸桿菌等致病菌數(shù)量增加。研究發(fā)現(xiàn)，酸化劑能顯著提高仔豬腸道和糞便內(nèi)乳酸菌的數(shù)量，降低大腸桿菌的數(shù)量[5-6]。苯甲酸作為酸化劑也顯著提高斷奶仔豬回腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量[8]，降低大腸桿菌的數(shù)量[24]。通過體外方法比較不同單一酸對豬空腸和回腸食糜中大腸桿菌和沙門氏菌抑菌效果時發(fā)現(xiàn)，苯甲酸能顯著抑制沙門氏菌、大腸埃希菌和總細(xì)菌的繁殖[25]。本研究表明，21日齡斷奶仔豬飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著降低仔豬腸道內(nèi)總細(xì)菌、芽孢桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量，有降低大腸桿菌數(shù)量的趨勢，同時顯著提高乳酸桿菌的數(shù)量。這些結(jié)果說明苯甲酸不僅能夠抑制大腸桿菌的生長，也抑制雙歧桿菌和芽孢桿菌等有益菌的生長。跟前人的報道不一致。其他研究也有報道，添加苯甲酸對腸道乳酸桿菌的數(shù)量沒有顯著影響[26]或者有降低的報道[27]。這種差異可能是與仔豬日齡或者豬舍環(huán)境有關(guān)系。Kluge等[28]研究報道，飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著降低仔豬回腸內(nèi)容物總細(xì)菌、十二指腸革蘭氏陰性菌和胃內(nèi)總需氧菌和總厭氧菌的數(shù)量。這表明苯甲酸對腸道菌群有抑制作用。苯甲酸抑菌的原理可能是低濃度的苯甲酸大多數(shù)處于未電離狀態(tài)。沒有電離的有機(jī)酸分子具有親脂性可以進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，從而干擾細(xì)菌及霉菌等微生物細(xì)胞的通透性，抑制細(xì)胞膜對氨基酸的吸收[29]。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的苯甲酸改變細(xì)菌體內(nèi)氫離子(H+)的平衡，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，各種酶的活性受到抑制，最終達(dá)到抑菌的目的[30]。腸道內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的降低，能夠減少微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，提高飼料的利用效率。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，飼糧中添加5 000 mg/kg的苯甲酸顯著促進(jìn)腸道乳酸桿菌生長，抑制總細(xì)菌、芽孢桿菌等其他細(xì)菌生長；同時，添加苯甲酸顯著降低仔豬腹瀉率，提高生長性能。