詹經(jīng)緯 童津津* 熊本海 蔣林樹

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

乳腺炎是全球乳業(yè)最流行、造成經(jīng)濟(jì)損失最大的疾病之一，如果能在乳腺炎之前更早地發(fā)現(xiàn)乳腺內(nèi)感染，并進(jìn)行隔離、治療等相應(yīng)措施，將極大地減少牛場經(jīng)濟(jì)損失。乳中體細(xì)胞數(shù)(somatic cell count，SCC)升高是乳腺內(nèi)感染、乳腺損傷的結(jié)果，會影響奶牛的泌乳性能[1]，同時(shí)乳中和血液中免疫相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子會發(fā)生相應(yīng)的變化[2-4]。雖然SCC能在一定程度上反映乳腺的健康狀況，但很多研究發(fā)現(xiàn)僅僅通過SCC來判斷乳腺健康是不嚴(yán)格的，存在一定的局限性[5-7]。目前，國內(nèi)外已有諸多報(bào)道提出了新指標(biāo)體細(xì)胞分型指數(shù)(differential somatic cell count，DSCC)，表明其可以作為SCC的附加指標(biāo)來監(jiān)測奶牛乳腺內(nèi)感染情況，能在低SCC的奶牛中檢測出處于炎癥早期的奶牛，揭示發(fā)病奶牛處于炎癥的何種階段，并且可以反映奶牛的乳腺健康及泌乳性能的狀態(tài)[8-10]。本文圍繞以上主題，結(jié)合國內(nèi)外近年來的研究成果進(jìn)行綜述。

1 乳中SCC作為指示乳腺炎的指標(biāo)

乳腺炎是乳腺組織發(fā)生的一種炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為牛乳成分異常、產(chǎn)奶量下降等問題。誘發(fā)因素較多，主要包括病原微生物侵襲、營養(yǎng)不良、環(huán)境不適、擠奶方式不當(dāng)?shù)?，但?xì)菌感染是造成乳腺炎的最主要病因[1]。傳染性病原菌(包括無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、牛棒狀桿菌等)是檢出率最高的病原菌，引起奶牛臨床型乳腺炎和隱型乳腺炎。環(huán)境型病原菌(包括乳腺鏈球菌、埃希氏大腸桿菌、變形桿菌等)通常引起臨床型乳腺炎[11]。機(jī)會型病原菌如凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)通常引起隱型乳腺炎。由于隱型乳腺炎給奶牛泌乳帶來不利影響的同時(shí)，不易被發(fā)現(xiàn)且具有傳染性，對牛場造成的經(jīng)濟(jì)損失更為嚴(yán)重。

牛乳中的SCC指每毫升牛乳中的總細(xì)胞數(shù)，多數(shù)是免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)，約占SCC的99%；乳腺組織脫落的上皮細(xì)胞約占1%[12]。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺內(nèi)感染(intramammary infection，IMI)，乳中SCC升高，尤其是白細(xì)胞數(shù)目明顯增長，原因是細(xì)菌及其代謝物誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞(PMN)進(jìn)入乳腺[13]。因此，乳中SCC能很好地反映奶牛乳腺的健康狀況和乳品質(zhì)，正常情況下牛乳中的SCC小于20萬個(gè)/mL，而當(dāng)乳腺有外傷或者發(fā)生乳腺炎時(shí)SCC會超過20萬個(gè)/mL[14]。有研究表明，引起SCC變化的因素很多，隨著奶牛年齡及胎次的增加，SCC有升高的趨勢[15]。可能的原因有多種，老齡奶牛的乳頭管更容易發(fā)生損傷，愈合更慢，增加了細(xì)菌侵入的機(jī)會，且其免疫機(jī)能下降，清除病原菌的效率降低。此外，產(chǎn)犢初期奶牛乳中的SCC也顯著升高，這是因?yàn)榇藭r(shí)機(jī)體免疫力較低，病原菌容易入侵并增殖[16]。夏季的SCC在1年內(nèi)最高，因?yàn)橄募炯?xì)菌最活躍，奶牛出現(xiàn)熱應(yīng)激的情況也增多，導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)病率增加。研究發(fā)現(xiàn)，泌乳末期的奶牛SCC也增高，這是產(chǎn)奶量降低產(chǎn)生的結(jié)果，但不患隱型乳腺炎的奶牛這種現(xiàn)象不明顯[15]。雖然引起SCC升高的原因有很多，但最主要的因素是乳腺炎的發(fā)生。因此，對于肉眼無法判別病癥的奶牛，可以檢測SCC判斷其是否患有隱型乳腺炎。

2 乳中SCC與乳腺健康相關(guān)性研究

當(dāng)乳腺內(nèi)感染發(fā)生后，病原菌增殖使乳腺上皮細(xì)胞開始損傷，若感染持續(xù)存在，乳腺內(nèi)SCC不斷增加導(dǎo)致乳腺組織損傷惡化，最終腺體中腺泡完整結(jié)構(gòu)被破壞，血乳屏障受損，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[17]。因此，SCC升高早于乳腺炎的發(fā)生，這是乳腺健康狀態(tài)受損，機(jī)體啟動(dòng)免疫反應(yīng)的結(jié)果，并且會影響奶牛的泌乳性能。所以，檢測牛乳中的SCC來判斷乳腺健康狀況具有一定的指示性。

2.1 乳中SCC變化與泌乳性能相關(guān)性研究

健康牛乳中SCC應(yīng)小于20萬個(gè)/mL，當(dāng)乳腺發(fā)生感染時(shí)，最重要的表現(xiàn)就是SCC發(fā)生不同程度的升高，引起奶牛泌乳性能的變化，主要包括奶牛的產(chǎn)奶量、牛乳中乳蛋白率、乳糖率和乳脂率的變化等[18-19]。目前，關(guān)于乳中SCC與產(chǎn)奶量及乳成分的相關(guān)性研究得到了廣泛關(guān)注，SCC可作為表型特征指示乳品質(zhì)量，其升高通常是因?yàn)槿橄賰?nèi)已經(jīng)發(fā)生了感染，感染區(qū)PMN數(shù)劇烈增長；若感染未及時(shí)消除，則會導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生，SCC進(jìn)而持續(xù)升高[20]。Costa等[21]對意大利地區(qū)大規(guī)模牛場的奶牛數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)SCC逐漸升高的情況下，產(chǎn)奶量和乳糖含量顯著降低，但對乳脂率和乳蛋白率無顯著影響。祝語等[22]對昆明地區(qū)某牛場3 000頭奶牛的生產(chǎn)性能測定(dairy herd improvement，DHI)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SCC與乳蛋白率呈極顯著正相關(guān)，與乳糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，但不同SCC組間乳脂率差異不顯著。韓麗云等[23]將寧夏地區(qū)325頭荷斯坦奶牛SCC數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為體細(xì)胞評分(SCS)，發(fā)現(xiàn)乳中SCS與日產(chǎn)奶量呈顯著負(fù)相關(guān)，與乳糖含量呈正相關(guān)，但與乳脂率無顯著相關(guān)性。田悅珍等[24]對新疆2個(gè)牛場1 500余條DHI數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著新疆褐牛乳中SCC增加，產(chǎn)奶量、乳糖率和乳脂率均下降。

以上各地區(qū)對奶牛SCC與泌乳性能相關(guān)分析表明，乳中SCC的升高通常造成：1)產(chǎn)奶量下降[23-24]。因?yàn)楦逽CC的奶牛大多是由于乳腺內(nèi)病原菌增多，這些細(xì)菌分泌毒素，造成乳腺上皮細(xì)胞損傷等，進(jìn)而導(dǎo)致了產(chǎn)奶量下降。也有特殊情況，如CNS引發(fā)的乳腺早期感染，導(dǎo)致SCC升高的同時(shí)不會造成產(chǎn)奶量的下降[25]。2)乳蛋白率升高[22-23]。由于SCC的升高伴有血-乳屏障的滲透性增加，使得血液中的免疫球蛋白、乳鐵蛋白、白蛋白等流入乳中，從而導(dǎo)致了乳蛋白率的升高[26]。然而，這種牛乳中增加的乳蛋白通常是乳清蛋白和一些免疫蛋白，相反，對人體有益的酪蛋白顯著減少[27]，可能是因?yàn)榛罨睾湍[瘤生長因子-β抑制了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)反式激活和STAT5介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致酪蛋白含量的下降[28]。因此這種乳蛋白率的增加對乳品質(zhì)是有害的。3)乳糖率下降[22-24]。當(dāng)SCC高時(shí)會強(qiáng)烈刺激奶牛機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，造成奶牛精神不振，食欲不佳，飼糧攝入營養(yǎng)不足，從而在乳糖合成時(shí)D-半乳糖和D-葡萄糖供應(yīng)不足，導(dǎo)致乳糖合成量下降[23]。同時(shí)，高SCC的奶牛乳腺組織損傷，毛細(xì)血管破裂，血液滲透進(jìn)入乳中，導(dǎo)致血-乳之間的滲透壓降低，從而降低了乳糖向牛乳中的滲透[29]，并且乳腺上皮細(xì)胞的載體破損，導(dǎo)致乳糖的流失。4)對于乳脂率變化尚未有統(tǒng)一的定論。理論上SCC升高常常伴隨乳脂合成和分泌降低，并且使乳中含有大量游離脂肪酸，牛乳中會出現(xiàn)脂肪氧化，具有苦、澀等不良?xì)馕禰23]。有研究報(bào)道，隨著SCC的升高，乳脂率應(yīng)呈現(xiàn)下降趨勢，但由于產(chǎn)奶量的減少，乳脂總量減少與濃縮效應(yīng)產(chǎn)生抵消，故而各項(xiàng)研究中乳脂率差異不同[23-24]。

2.2 乳中SCC變化與抗氧化及免疫指標(biāo)相關(guān)性研究

目前研究表明，當(dāng)牛乳SCC變化時(shí)，乳汁或者血液中相關(guān)酶類物質(zhì)、免疫球蛋白、急性期蛋白及細(xì)胞因子等含量或活性也隨之發(fā)生變化[2]。程艷艷等[3]發(fā)現(xiàn)高SCC組奶牛的血液和乳汁中的丙二醛(MDA)含量顯著高于低SCC組，而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性隨著SCC的升高有遞減的趨勢。伊柏雙等[4]也發(fā)現(xiàn)了高SCC且已經(jīng)發(fā)生乳腺炎的奶牛，血清中SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)活性顯著低于健康奶牛，說明奶牛SCC越高，炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重，其抗氧化能力越差，這些指標(biāo)可作為判定乳腺感染的依據(jù)。據(jù)報(bào)道，乳腺內(nèi)起抗菌作用的免疫球蛋白(Ig)主要包括IgG1、IgG2、IgA和IgM[4]。其中IgG1、IgG2、IgM可作為調(diào)理素提高PMN和巨噬細(xì)胞的吞噬作用；而IgA主要通過凝聚入侵的細(xì)菌防止其在乳腺內(nèi)擴(kuò)散[30]。正常乳汁中的IgG1含量最高，細(xì)菌感染導(dǎo)致高SCC乳汁中免疫球蛋白含量增加，但不同病原菌感染引起的Ig含量變化有差異[4]。乳汁中IgG1、IgG2含量的增加可能是由大腸埃希氏桿菌毒力成分脂多糖(LPS)誘導(dǎo)，而乳汁中只有IgG2含量增加，IgG1含量不變則有可能是金黃色葡萄球菌毒力成分脂磷壁酸(LTA)誘導(dǎo)發(fā)生的[2]。

據(jù)報(bào)道，SCC與急性期蛋白、免疫相關(guān)蛋白及免疫因子有密切關(guān)系[31-33]。沈維軍等[19]在對高SCC牛乳蛋白成分的研究中發(fā)現(xiàn)，高SCC牛奶中增加的蛋白為急性期蛋白(如白蛋白、結(jié)合珠蛋白和α1酸性蛋白)和免疫相關(guān)蛋白(如轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白抗菌肽1和IgG等)。白蛋白在血漿中含量較高，血乳屏障受損后導(dǎo)致其流入牛乳。結(jié)合珠蛋白和α1酸性糖蛋白通常在肝內(nèi)合成，PMN和乳腺細(xì)胞也可合成，乳腺炎剛開始時(shí)，可以觀察到這2種蛋白含量的迅速增加[31-32]?？咕木哂懈呖咕钚?，在機(jī)體自然免疫中發(fā)揮作用。因此，高SCC的牛乳中抗菌肽1含量的增加可能是機(jī)體啟動(dòng)免疫反應(yīng)、對抗感染的表現(xiàn)[33]。當(dāng)乳腺剛感染時(shí)，乳腺上皮細(xì)胞釋放趨化因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)，使PMN遷移到乳腺中造成SCC快速增長。PMN釋放炎性細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和趨化因子IL-8]，促進(jìn)急性期炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮相關(guān)的免疫功能，進(jìn)而加強(qiáng)對病原菌的有效清除[17]。若是持續(xù)、慢性的炎癥，SCC不斷增加的同時(shí)，造成臨床型乳腺炎，則奶牛血清中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量升高，但造成隱型乳腺炎的血清中這些細(xì)胞因子的差異不顯著[17,34]。

3 DSCC與乳腺健康的關(guān)系

3.1 乳中SCC檢測的局限性

國際乳業(yè)聯(lián)合會建議同時(shí)使用乳中SCC和細(xì)菌學(xué)分析來確定乳腺健康[35]。因此，奶牛乳腺是否感染應(yīng)該以細(xì)菌學(xué)檢測作為參考標(biāo)準(zhǔn)(國際乳腺委員會，2004)。盡管如此，一些已感染乳腺炎的奶牛并未出現(xiàn)SCC增加，但細(xì)菌學(xué)分析呈假陰性結(jié)果[5]。特別是對于凝固酶陰性葡萄球菌，這種細(xì)菌可能是引發(fā)早期乳腺炎的潛在致病病原體，會造成SCC升高，但對奶牛生產(chǎn)性能無不利影響；有時(shí)它們只存在于乳頭皮膚上，會導(dǎo)致樣本的細(xì)菌學(xué)檢測呈假陽性結(jié)果，其實(shí)并非乳腺內(nèi)感染[25]，那么對感染乳區(qū)的識別仍然存在困難。

乳中SCC判斷乳腺炎的發(fā)生，存在一定的局限性。在Schwarz等[5]對德國某牛群乳腺炎的研究中，對乳腺健康的標(biāo)準(zhǔn)很高，將區(qū)分乳腺是否感染的閾值確定為100 000個(gè)/mL。然而，即使在SCC≤100 000個(gè)/mL的乳汁中，出乎意料地檢測到了高數(shù)量的病原體。甚至在一些SCC為1 000個(gè)/mL左右的樣本中也檢測出主要病原體(金黃色葡萄球菌及無乳鏈球菌)和次要病原體(CNS及棒狀桿菌屬)，這使作者懷疑SCC為100 000個(gè)/mL的閾值無法判斷乳腺是否已經(jīng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。汪悅等[25]在奶牛SCC研究中發(fā)現(xiàn)，在SCC<100 000個(gè)/mL時(shí)，乳腺內(nèi)早期炎癥可能已經(jīng)出現(xiàn)。然而有小部分樣品平均SCC>300 000個(gè)/mL，遠(yuǎn)超過100 000個(gè)/mL的閾值，但其細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果呈陰性未感染?？偠灾谝恍┑蚐CC的奶牛乳腺中，實(shí)際可能已經(jīng)發(fā)生了感染，但此時(shí)乳腺內(nèi)以PMN的大量聚集為主，還不能檢測到SCC的顯著升高[6]；并且當(dāng)某些細(xì)菌如金黃色葡萄球菌，感染乳腺后會釋放一種殺白細(xì)胞素，導(dǎo)致感染后SCC也不會明顯上升[7]。一些高SCC奶牛，甚至達(dá)到SCC>40萬個(gè)/mL，但此時(shí)其乳腺內(nèi)病原菌已經(jīng)被清除了，處于痊愈過程中，是由于炎癥反應(yīng)依然活躍造成的高SCC[25]。因此，SCC計(jì)數(shù)雖是一種比較可靠的指示乳腺炎的指標(biāo)，然而不能準(zhǔn)確地判斷乳腺是否發(fā)生感染，也不能將牛奶中存在的體細(xì)胞區(qū)分為不同的類型[6]，僅僅依賴乳中SCC來判斷乳腺感染的情況是不嚴(yán)格的。

3.2 DSCC可以更明確地指示乳腺炎情況

在乳腺中，免疫細(xì)胞(主要為淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和PMN)的數(shù)量和分布可以反映炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[6]。隨著炎癥的發(fā)展，各種免疫細(xì)胞反應(yīng)不同，只應(yīng)用SCC來指示炎癥的發(fā)生，存在局限性[36]。已有多項(xiàng)研究[8,10,36-38]表明，DSCC有利于更明確地描述奶牛乳腺健康的實(shí)際情況，可以將PMN、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞作為一個(gè)整體，DSCC代表PMN和淋巴細(xì)胞占整體的比例之和，巨噬細(xì)胞用100%減去DSCC得到[8]，這可以顯示不同細(xì)胞比例的變化并揭示炎癥反應(yīng)正處于哪個(gè)階段，即使在SCC為1 000個(gè)/mL的樣本中，仍具有較好的指示效果[35]。Pillai等[9]在研究炎性細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞計(jì)數(shù)和PMN計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，SCC較多的乳區(qū)其PMN數(shù)也比較高，并且相對于3次細(xì)菌學(xué)檢測陰性的乳區(qū)(PMN比例為17%～25%)，3次細(xì)菌學(xué)檢測陽性的乳區(qū)中PMN的比例更高(33%～59%)，這些均說明乳區(qū)發(fā)生感染后會導(dǎo)致SCC增加，并且很大一部分是由于PMN數(shù)的增加導(dǎo)致的。Schwarz等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在極低SCC(<6 250個(gè)/mL)的樣本中，淋巴細(xì)胞的比例高達(dá)88%；在6 250個(gè)/mL100 000個(gè)/mL的15個(gè)病區(qū)乳樣中，有13個(gè)樣本以PMN為主要細(xì)胞群體[6]。這說明在極低SCC的樣本中，若檢測到高比例的PMN，則很有可能已經(jīng)發(fā)生乳腺內(nèi)感染。此外，Wall等[10]在脂多糖和脂磷壁酸誘導(dǎo)的乳腺炎癥反應(yīng)中，觀察到乳腺炎早期高SCC和高DSCC，而治愈期DSCC顯著下降；因此，提出了將高SCC(SCC≥20萬個(gè)/mL)以及DSCC(DSCC<86%或DSCC>86%)，來判斷乳腺炎處于早期或晚期進(jìn)而指示健康狀態(tài)。在SCC已知的情況下，附加DSCC能描述關(guān)于IMI狀態(tài)的重要性息，但這取決于感染的病原體。Kirkeby等[36]對此作了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)對于已經(jīng)感染主要病原體(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌等)的奶牛，附加DSCC可以顯著改善對任一病原體的指征；對于“健康的”奶牛，附加DSCC也可以顯著改善對次要病原菌(棒狀桿菌、CNS等)的指示能力。

直到2017年，世界各地已經(jīng)開發(fā)出了檢測細(xì)胞分型的方法，但還沒有高通量檢測DSCC的常規(guī)方法。Damm等[8]利用FOSS DSCC法測定DSCC等參數(shù)，并與現(xiàn)有的成熟方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證了隨著SCC的增加，PMN的比例增加，巨噬細(xì)胞的比例減少，而淋巴細(xì)胞數(shù)量在整個(gè)炎癥過程中一直處于很低的狀態(tài)。因此，DSCC反映了PMN和巨噬細(xì)胞的反比例關(guān)系，并且該方法特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性都很強(qiáng)，且為低成本、可重復(fù)、快速、準(zhǔn)確并同時(shí)檢測單個(gè)牛乳樣本中的DSCC和SCC提供了方法，增加了將DSCC添入DHI框架內(nèi)的可能。近幾年，有研究發(fā)現(xiàn)DSCC與乳品質(zhì)存在顯著的相關(guān)性[37-38]。Zecconi等[37]對意大利地區(qū)牛群分析結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)在SCC很低的奶牛中，隨著DSCC增加，乳脂率、乳蛋白率特別是酪蛋白率顯著降低，那么DSCC可作為低SCC奶牛乳成分變化的標(biāo)志。Stcco等[38]對DSCC與乳品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)DSCC的變化對乳中的乳脂率和乳糖率影響最大，分別呈負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系，特別是在DSCC剛開始上升時(shí)，可作為判斷這2種乳成分變化的依據(jù)。在高DSCC(DSCC≥78.5%)時(shí)，乳蛋白率和酪蛋白率顯著下降，且此時(shí)SCC的變化也影響酪蛋白率。因此，附加DSCC指標(biāo)可用于農(nóng)場(減少抗菌劑的使用)到奶廠(進(jìn)一步評估牛奶品質(zhì)和價(jià)值)的多重監(jiān)控。

4 小 結(jié)

乳中SCC是一項(xiàng)比較可靠的判斷乳腺健康的指標(biāo)，在我國已沿用多年，可粗略反映乳腺是否發(fā)生炎癥，并在一定程度上指示奶牛的泌乳性能和乳腺的健康狀態(tài)。若結(jié)合新參數(shù)DSCC可以更準(zhǔn)確地監(jiān)測乳腺健康，更早地發(fā)現(xiàn)感染奶牛，同時(shí)可以進(jìn)一步判斷乳品質(zhì)量。但是，DSCC在DHI框架內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用還需要進(jìn)一步的探討，乳腺感染的復(fù)雜性需要廣泛的縱向研究。