何 斌 薛 珉 余蘇云 貝頌華 高習(xí)文

(復(fù)旦大學(xué)附屬閔行區(qū)中心醫(yī)院1 呼吸內(nèi)科，2 內(nèi)鏡中心，上海市 201199，電子郵箱：hebing20190@126.com)

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，2019年國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，在農(nóng)村、城市其發(fā)病率分居惡性腫瘤譜的第5位、第2位，且呈逐漸上升、年輕化趨勢(shì)[1]。盡管近年來(lái)診療技術(shù)和靶向藥物快速發(fā)展，但結(jié)直腸癌患者的預(yù)后依然不理想，中位生存時(shí)間僅為30個(gè)月[2]。間歇性缺氧是阻塞型睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAHS)的重要特征[3]。研究表明，間歇性缺氧所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)和缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)表達(dá)水平的升高與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。OSAHS可通過(guò)間歇性缺氧影響結(jié)直腸癌的病理生理特征，但具體機(jī)制仍未完全闡明[5]。因此，本研究探討合并OSAHS的結(jié)直腸癌患者的腸道菌群狀況及其慢性間歇性缺氧狀況與病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月至2018年12月間在我院就診或體檢的100例患者或體檢者作為研究對(duì)象，其中健康者(對(duì)照組)、結(jié)直腸癌合并OSAHS患者(結(jié)直腸癌+OSAHS組)、單純結(jié)直腸癌患者(結(jié)直腸癌組)、單純OSAHS患者(OSAHS組)各25例。結(jié)直腸癌患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均經(jīng)手術(shù)病理確診，且臨床資料齊全；(2)術(shù)前未接受放化療或其他抗腫瘤治療；(3)排除合并其他腫瘤及心肝腎等重要器官?lài)?yán)重功能不全者。OSAHS患者入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)OSAHS診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)睡眠呼吸紊亂指數(shù)≥40次/h；(3)排除慢性阻塞性肺疾病患者、心肝腎等重要器官?lài)?yán)重功能不全者。各組的性別構(gòu)成比、年齡等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，結(jié)直腸癌+OSAHS組與結(jié)直腸癌組患者在Dukes分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。本研究符合《赫爾辛基宣言》的倫理學(xué)要求，患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

表1 4組一般資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 病理資料收集：結(jié)直腸癌患者均于術(shù)中留取腫瘤病灶組織標(biāo)本，送病理檢查，明確Dukes分期、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等情況。

1.2.2 糞便腸道菌群計(jì)數(shù)及種類(lèi)鑒定：(1)收集所有研究對(duì)象的適量新鮮糞便，30 min內(nèi)送檢，其中結(jié)直腸癌患者在術(shù)前3 d采集，其余研究對(duì)象在腸鏡檢查前3 d采集。(2)稱(chēng)取0.1 g糞便標(biāo)本置于EP管，加入0.9 mL生理鹽水混勻，倍比稀釋?zhuān)来蜗♂?0倍、102倍、103倍；將不同稀釋度的標(biāo)本分別接種于需氧菌、厭氧菌培養(yǎng)基上進(jìn)行初次分離培養(yǎng)，其中需氧菌培養(yǎng)條件為37℃(18～24 h)，厭氧菌培養(yǎng)條件為37.5℃(24～48 h)；在相應(yīng)時(shí)間內(nèi)若未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，則繼續(xù)按原條件培養(yǎng)至1周。確定平板上的目的菌后，利用平板計(jì)數(shù)法對(duì)菌株進(jìn)行計(jì)數(shù)；根據(jù)平板活菌計(jì)數(shù)和稀釋倍數(shù)，按下列公式計(jì)算活菌計(jì)數(shù)，活菌數(shù)量=lg[每毫升糞便標(biāo)本活菌集落數(shù)量(CFU/mL)]，每毫升糞便標(biāo)本活菌集落數(shù)量(CFU/mL)=(標(biāo)本質(zhì)量+稀釋量)/標(biāo)本質(zhì)量×稀釋倍數(shù)×菌落個(gè)數(shù)[7]；以稀釋倍數(shù)102倍計(jì)算所得為最終結(jié)果。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)：(1)通過(guò)手術(shù)或腸鏡檢查采集所有研究對(duì)象的結(jié)直腸組織樣本，其中結(jié)直腸癌患者的標(biāo)本包括腫瘤病灶組織及病灶周?chē)? cm外的癌旁組織，對(duì)照組、OSAHS組腸鏡檢查時(shí)取結(jié)直腸黏膜標(biāo)本(升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸各取活檢2塊)。(2)采用鏈菌素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連結(jié)法染色，具體操作如下：取得結(jié)直腸組織樣本后，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋，制作厚度為3 μm的組織切片4張，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后加入3% H2O2，室溫孵育10 min，再用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；將切片置于1.0%枸櫞酸緩沖液持續(xù)煮沸2 min后取出冷卻，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；加入山羊血清37℃孵育15 min，加入一抗HIF-1免疫組化單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：131105554F)、谷氨酰胺酶2(glutaminase 2，GLS2)免疫組化單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1303189902)，37℃孵育60 min；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，磷酸緩沖鹽溶液沖洗3遍；滴加新鮮配制的3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯色(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào):81215710)15 min，自來(lái)水沖洗10 min終止反應(yīng)，再?gòu)?fù)染、脫水、透明、封片。(3)為了排除假陽(yáng)性和假陰性，采用HIF-1、GLS2陽(yáng)性的結(jié)直腸組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，采用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗作為陰性對(duì)照。所有標(biāo)本均由兩名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估；如意見(jiàn)不統(tǒng)一，則由第3名病理醫(yī)師共同商討得出統(tǒng)一結(jié)論。(4)采用半定量分級(jí)計(jì)分方法[8]評(píng)估HIF-1、GLS2的表達(dá)情況：HIF-1、GLS2蛋白均主要位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色；染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞占比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)為≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、≥51%為3分；以染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞占比得分的乘積作為陽(yáng)性系數(shù)，陽(yáng)性系數(shù)為0～1分判定為該因子陰性表達(dá)，陽(yáng)性系數(shù)≥2分則判定為該因子陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間比較采用F′檢驗(yàn)，兩兩比較采用Welch檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法，兩兩比較采用Bonferroni校正法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Bonferroni校正法時(shí)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05/K，K為比較的次數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 4組主要腸道菌群的活菌集落數(shù) 本研究主要鑒定出5種腸道細(xì)菌，分別是乳酸桿菌、脆弱擬桿菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌、糞腸球菌。4組主要腸道菌群的活菌集落數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；其中，結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組、OSAHS組、對(duì)照組的乳酸桿菌集落數(shù)依次升高，大腸埃希菌集落數(shù)依次降低；結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組的脆弱擬桿菌、糞腸球菌集落數(shù)均高于OSAHS組、對(duì)照組，雙歧桿菌集落數(shù)均低于OSAHS組、對(duì)照組(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組腸道菌群分布情況的比較(x±s，CFU/mL)

2.2 各組HIF-1、GLS2的陽(yáng)性率比較 與對(duì)照組比較，結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組、OSAHS組的HIF-1、GLS2表達(dá)陽(yáng)性率均升高(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組HIF-1、GLS2陽(yáng)性率的比較[n(%)]

2.3 結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁組織HIF-1、GLS2的陽(yáng)性率的比較 結(jié)直腸癌+OSAHS組和結(jié)直腸癌組中，與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織HIF-1、GLS2陽(yáng)性率均升高(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁組織HIF-1、GLS2的陽(yáng)性率的比較[n(%)]

2.4 結(jié)直腸癌+OSAHS組患者HIF-1、GLS2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 浸潤(rùn)深度≥T2期、Dukes分期為C～D期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌+OSAHS患者的GLS2陽(yáng)性率升高，合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌+OSAHS患者的HIF-1陽(yáng)性率升高(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 結(jié)直腸癌+OSAHS組患者HIF-1、GLS2陽(yáng)性率與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

近年來(lái)，OSAHS發(fā)病率不斷升高，成人OSAHS患病率高達(dá)4%，60歲以上人群患病率可高達(dá)20%～40%，該病嚴(yán)重影響患者的生活工作質(zhì)量，對(duì)健康和生命具有極大危害[9]。OSAHS的病理生理特征表現(xiàn)為睡眠中氣道塌陷阻塞、氣流受限，引起反復(fù)間歇性缺氧、二氧化碳潴留、睡眠片段化，造成內(nèi)分泌功能紊亂、神經(jīng)調(diào)節(jié)功能失衡、血流動(dòng)力學(xué)改變及微循環(huán)異常等變化，最終導(dǎo)致多系統(tǒng)器官功能損害；由于機(jī)體的保護(hù)性反應(yīng)，OSAHS患者夜間可出現(xiàn)反復(fù)覺(jué)醒、通氣加快，這使得間歇性缺氧癥狀可獲得緩解，但入睡后再次出現(xiàn)間歇性缺氧。這種缺氧/復(fù)氧過(guò)程類(lèi)似于缺血/再灌注狀態(tài)，可引起機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧簇，進(jìn)而誘發(fā)HIF-1、GLS2等對(duì)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，促發(fā)炎癥因子聚集，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。

腸道菌群具有腸黏膜生物屏障的作用，在食物消化與吸收、腸黏膜上皮細(xì)胞增殖更新、抵抗病原體及炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用；當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，腸黏膜上皮細(xì)胞與腸道微環(huán)境將出現(xiàn)功能性變化，可誘發(fā)結(jié)直腸癌等多種疾病[11]。OSAHS可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。Martínez-García等[13]通過(guò)多中心臨床研究對(duì)OSAHS患者隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，有9.4%患者被確診為癌癥，其癌癥發(fā)病率遠(yuǎn)高于普通人群，但其具體機(jī)制仍有待研究。最近有研究顯示，間歇性缺氧可改變腸道菌群的多樣性：研究者通過(guò)構(gòu)建間歇性缺氧小鼠模型來(lái)模擬OSAHS，飼養(yǎng)6周后取糞便進(jìn)行菌群分析，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照小鼠比較，間歇性缺氧小鼠的糞便出現(xiàn)菌群多樣性和構(gòu)成改變，其中擬桿菌、變形桿菌相對(duì)減少而硬壁菌群相對(duì)增加[14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組、OSAHS組、對(duì)照組的乳酸桿菌集落數(shù)依次升高，大腸埃希菌集落數(shù)依次降低，結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組的脆弱擬桿菌、糞腸球菌集落數(shù)均高于OSAHS組、對(duì)照組，雙歧桿菌集落數(shù)均分別低于OSAHS組、對(duì)照組(均P<0.05)，即結(jié)直腸癌+OSAHS組腸道菌群異常和微生態(tài)紊亂更為明顯，厭氧菌與需氧菌比例失衡，這表明OSAHS可促進(jìn)結(jié)直腸癌患者的腸道菌群紊亂。同時(shí)，結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組及OSAHS組的HIF-1、GLS2陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組，且結(jié)直腸癌+OSAHS組、結(jié)直腸癌組腫瘤病灶組織的HIF-1、GLS2陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁組織(P<0.05)，這與鄧立勇等[15]的研究結(jié)果相似。已有研究證實(shí)，腸道菌群與炎癥的發(fā)生關(guān)系密切，在炎癥刺激下可通過(guò)產(chǎn)生活性氧自由基誘發(fā)結(jié)腸黏膜的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過(guò)HIF-1、GLS2等促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，從而造成DNA損傷，進(jìn)而激活癌基因或抑制抑癌基因，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[16]。有研究顯示，腸道菌群的變化可通過(guò)促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中內(nèi)源性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素17C過(guò)表達(dá)來(lái)影響下游Toll樣受體/髓樣分化因子信號(hào)通路，從而誘發(fā)結(jié)直腸組織發(fā)生癌變[17]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度的增大、Dukes分期增高或出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌+OSAHS組患者GLS2陽(yáng)性率明顯升高，而合并淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌+OSAHS組患者HIF-1陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)。研究表明，HIF-1、GLS2參與了腫瘤細(xì)胞的血管形成、增殖凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展，且HIF-1能通過(guò)調(diào)控GLS2表達(dá)等多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥，從而削弱患者治療效果[18]。這提示OSAHS所致慢性間歇性缺氧可能與結(jié)直腸癌患者的病理特征甚至預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，合并OSAHS的結(jié)直腸癌患者存在明顯的腸道菌群紊亂，OSAHS可能通過(guò)影響腸道菌群引起結(jié)直腸癌，并與結(jié)直腸癌的病理特征密切相關(guān)。