馬婕, 李開枝, 邱大俊, 譚燁輝, 黃良民,3,* , 張俊彬

基于高通量測序技術(shù)大亞灣肥胖軟箭蟲()的食性分析

馬婕1,2,4, 李開枝2, 邱大俊2, 譚燁輝2, 黃良民2,3,*, 張俊彬1,4,*

1. 國家實驗漁業(yè)科學(xué)教育示范中心, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)遺傳資源開發(fā)利用重點實驗室, 上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程研究中心, 上海 201306 2. 中國科學(xué)院南海海洋研究所, 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室, 廣州 510301 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 4.深圳大學(xué)生命科學(xué)與海洋學(xué)院, 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點實驗室, 深圳 518000

采用Illuminate高通量測序技術(shù)分析了大亞灣肥胖軟箭蟲()的食性。在夏季(2017年8月)和冬季(2018年1月)對大亞灣內(nèi)不同站位拖網(wǎng)采獲的四組樣品中, 分別挑取毛顎類優(yōu)勢種肥胖軟箭蟲進(jìn)行18S rDNA V4區(qū)擴增; 通過高通量測序得到四組樣品的序列, 經(jīng)過處理每組樣品得到約30,000條高質(zhì)量序列。分析結(jié)果表明, 大亞灣肥胖軟箭蟲的食物來源于16個門類生物, 主要的優(yōu)勢類群分別來自于3個門類的浮游動物(刺胞動物門46.16%、節(jié)肢動物門的橈足類19.16%和櫛水母動物門14.22%), 真菌類的2個門類(子囊菌門14.04%和擔(dān)子菌亞門4.48%), 以及少量浮游植物類群的2個門 (褐藻門0.06%和隱藻門0.03%)。另外, 還檢測出少量肥胖軟箭蟲可能攝食的纖毛蟲、線蟲、住囊蟲、?？?。夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物中子囊菌門貢獻(xiàn)最高 (43.3%), 這與大亞灣海水養(yǎng)殖等人類活動影響有關(guān); 夏季灣口外海水帶來豐富的暖水性櫛水母, 占肥胖軟箭蟲總食物豐度的55.25%。冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲攝食哲水蚤比例達(dá)49.94%, 而灣口肉質(zhì)介穗水母占比高達(dá)85.3%。分析結(jié)果可見, 肥胖軟箭蟲的攝食具有偏好性, 且明顯存在季節(jié)和區(qū)域差異。研究探討了大亞灣不同環(huán)境下肥胖軟箭蟲食性轉(zhuǎn)變及其食物來源的季節(jié)和區(qū)域差異, 為深入揭示浮游動物在海灣生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)與能量傳遞過程的作用機制提供了重要基礎(chǔ)資料。

肥胖軟箭蟲; 大亞灣; 高通量測序; 18S rDNA; 食性

0 前言

毛顎類屬于海洋無脊椎肉食動物, 在數(shù)量上僅次于橈足類的第二大海洋浮游動物類群, 在分布上所有近岸、大洋和極地海區(qū)都有存在[1]。毛顎類是浮游動物的主要攝食者, 對生態(tài)系統(tǒng)起到重要的下行調(diào)控作用, 會對其攝食的浮游動物的群落結(jié)構(gòu)動態(tài)產(chǎn)生影響, 是海洋生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動的關(guān)鍵[2]。肥胖軟箭蟲()是毛顎類在溫帶和熱帶海區(qū)的廣布種, 也是大亞灣以至華南沿岸海區(qū)浮游動物的優(yōu)勢種[3]。目前對大亞灣肥胖軟箭蟲的研究主要集中在群落結(jié)構(gòu)、分布格局、生活史、種群動態(tài)變化與物理環(huán)境之間的耦合關(guān)系等內(nèi)容, 對其食性的報道還十分稀少。通過對肥胖軟箭蟲食性的研究, 將有助于深入了解浮游動物在大亞灣生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)與能量的遞過程及其作用提供重要參考。

大亞灣(14°29′—114°49′E, 22°30′—22°52′N)是典型的半封閉海灣, 也是受人類活動與自然影響雙重驅(qū)動的復(fù)合生態(tài)系統(tǒng)。自然影響主要體現(xiàn)在季節(jié)變化明顯, 海洋環(huán)境主要體現(xiàn)在外海(南中國海)以及粵東上升流帶來必要的營養(yǎng)鹽。人類活動影響主要體現(xiàn)在核電站熱效應(yīng)和近岸營養(yǎng)鹽與污染物質(zhì)的大量輸入[4]。周林濱等[5]發(fā)現(xiàn)大亞灣內(nèi)部食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)異化, 從浮游植物到浮游動物的能量傳遞不暢, 效率降低。毛顎類作為捕食者能通過直接抑制草食浮游動物而間接提高浮游植物的多樣性和生產(chǎn)力, 大亞灣生態(tài)環(huán)境的改變會直接或間接影響毛顎類的攝食, 進(jìn)而通過食物鏈傳遞影響生態(tài)系統(tǒng)功能。

大亞灣浮游動物的優(yōu)勢類群毛顎類攝食受到環(huán)境因子與自身因素的影響, 包括溫度、鹽度、食物豐度、以及毛顎類自身種類、大小、生長階段等。傳統(tǒng)的攝食研究方法較難獲得毛顎類食物組成的全面信息, 主要原因是毛顎類對食物的快速消化, 在28 ℃時消化時間僅為50分鐘[6]。其大部分腸道中存在半消化態(tài)的食糜, 人工鏡檢難以獲取真實攝食信息。餌料遞減法、同位素示蹤法都要依靠室內(nèi)培養(yǎng), 而室內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境難以全面還原大亞灣自然環(huán)境中毛顎類優(yōu)勢種肥胖軟箭蟲真實的攝食情況。近年來, 越來越多浮游動物攝食研究中運用了分子生物技術(shù), 通常使用通用或特異性引物來對浮游動物腸道或糞便中食物殘余進(jìn)行DNA擴增, 對擴增出來的片段進(jìn)行克隆和測序, 最終通過比對等實現(xiàn)對食物種類的確認(rèn)[7-10]。然而, 通用引物易導(dǎo)致攝食者自身序列的大量擴增, 常因測樣深度不夠而屏蔽了部分食物信息。過去常使用特異性引物阻斷攝食者自身序列的擴增的方法來化解該問題; 但特異性的引物針對的研究對象單一, 研究對象的改變需要重新設(shè)計該引物, 且阻斷引物的驗證過程費時費力, 限制了該方法在浮游動物食性研究中大量推廣使用。與傳統(tǒng)Sanger測序相比, 高通量測序更深, 可以避免傳統(tǒng)方法中測樣深度不夠而產(chǎn)生的問題, 能夠更全面的獲取攝食者的食物信息。因為18S rDNA 的普遍性、保守性、與唯一性[11, 12], 在不同區(qū)域進(jìn)化速度不同[13], 其中V4區(qū)域廣泛應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)和高級分類階元, 因V4區(qū)堿基數(shù)少、序列變異系數(shù)大、且易于擴增, 適用于高通量測序, 可用于攝食關(guān)系等的研究, 對特定的食物種類或者組群的檢測與鑒定[11, 12]。本研究選取了大亞灣受人類活動影響較大區(qū)域和影響較小區(qū)域的肥胖軟箭蟲, 利用18S rDNA的V4區(qū)域通用引物, 高通量測序的方法, 對比分析自然環(huán)境變化及人類活動對肥胖軟箭蟲現(xiàn)場食物組成和攝食偏好的影響, 旨在為闡釋大亞灣生態(tài)系統(tǒng)功能中營養(yǎng)輸送與食物鏈傳遞關(guān)鍵過程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣站點

2017年8月(夏季)和2018年1月(冬季), 在大亞灣14個站位采樣, 如圖1所示, 分為灣內(nèi)站(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S11、S12)和灣口站(S8、S9、S10、S13、S14)。

1.2 樣品采集

根據(jù)《海洋調(diào)查規(guī)范-海洋生物調(diào)查》, 使用淺水Ⅱ型網(wǎng)(孔徑160 μm)垂直拖網(wǎng)采集浮游動物。不采用海水沖網(wǎng), 防止毛顎類受驚嚇排便。樣品裝入500 mL廣口瓶中, 立即加入95%乙醇固定, -80 ℃冰箱保藏, 直至提取DNA。

圖1 大亞灣采樣站位(▲)圖。紅色區(qū)域代表灣內(nèi)站位, 藍(lán)色區(qū)域代表灣口站位

Figure 1 Locating of sampling stations (▲) in Daya Bay. The red and the blue circle area represent in the bay and bay mouth stations, respectively.

SM-5測深儀測量站位深度, YSI 6600多參數(shù)水質(zhì)檢測儀檢測水溫、鹽度和pH; 使用Niskin采水器采集表層水, 混勻后取500 mL用0.7 μm的純玻璃纖維濾紙(GFF)過濾, 收集濾膜, -20 ℃避光保存以測量葉綠素值。

1.3 肥胖軟箭蟲的挑取與預(yù)處理

在灣內(nèi)和灣口每個站位的浮游動物樣品中, 依據(jù)《海洋浮游生物學(xué)》[1]在體視顯微鏡下挑出肥胖軟箭蟲3份, 每份15只。挑選過程中注意選取腸道食物充足, 體表顏色正常的成體。用滅過菌的 0.22 μm聚碳酸酯膜過濾海水, 得到無菌海水(FSW)對挑選好的肥胖軟箭蟲單獨清洗, 至少清洗5遍, 去除表面附著物。用滅菌的解剖針將其腸道解剖分離, 為避免采樣過程網(wǎng)囊中攝食對結(jié)果的影響, 只保留后2/3的腸道食物[14]。腸道一經(jīng)采集, 立即使用液氮或者95%乙醇進(jìn)行保存, 保藏在-80 °C, 此溫度能降低核酸酶活性, 減少或完全抑制其對 DNA 的破壞。

1.4 PCR擴增與高通量測序

本實驗根據(jù)天根試劑盒(DNeasy Blood&Tissue Kit)說明書提取毛顎類腸含物DNA, 利用通用引物TAReuk454FWD1: (5’-CCAGCASYGCGGTAATT C-C-3’)和TAReukKREV3: (5’-ACTTTCGTTCTT GA-TYRA-3’)引物對18S rDNA V4區(qū)進(jìn)行PCR擴增[15]。擴增體系為20 μL, 4 μL5*FastPfu 緩沖液, 2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs, 上下游引物各0.8 μL(5 μm), 0.4 μL FastPfu 聚合酶; 10 ng DNA模板, 0.2 μL牛血清蛋白, 11.8 μL ddH2O。擴增程序為: 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 共27個循環(huán), 最后72 ℃延伸10 min (PCR儀: ABI GeneAmp? 9700型)。用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化, Tris-HCl洗脫。利用QuantiFluor?-ST (Promega, USA) 進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺 (Illumina, San Diego, USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫。構(gòu)建文庫步驟: (1)連接“Y”字形接頭; (2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段; (3)利用PCR擴增進(jìn)行文庫模板的富集; (4)氫氧化鈉變性, 產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 高通量數(shù)據(jù)分析

高通量測序得到的原始序列首先使用Trim-momatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控: (1)設(shè)置50 bp的窗口, 如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20, 從窗口開始截去后端堿基, 去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列; (2)條形碼需精確匹配, 引物允許2個堿基的錯配, 去除模糊堿基。其次, 過濾后獲得的序列使用FLASH軟件進(jìn)行拼接, 設(shè)置堿基重疊區(qū)域大于10 bp, 去除無法拼接的序列。再者, 使用的UPARSE軟件 (version 7.1 http://drive5.com/uparse/) , 根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類, 并進(jìn)行稀釋曲線劃分; 再通過UCHIME軟件剔除嵌合體。最后, 利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋, 比對Silva 數(shù)據(jù)庫 (https://www.arb- silva.de/,Version 128), 設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 肥胖軟箭蟲的自食現(xiàn)象

在本次研究中, 剔除了肥胖軟箭蟲自身的序列, 而在現(xiàn)場研究中我們觀測到成年肥胖軟箭蟲捕食成年同類的現(xiàn)象(如圖2)。曾有報道在食物并不缺乏的環(huán)境中, 浮游動物自食現(xiàn)象也很普遍[16]。Kehayias等[17]在地中海東部區(qū)域觀測到肥胖軟箭蟲同類相食率最高達(dá)5.1%, 其原因需要進(jìn)一步研究。本文探討通過18S rDNA高通量檢測得到的真核食物組成結(jié)果中不包括肥胖軟箭蟲的同類相食。

圖 2 肥胖箭蟲自食

Figure 2cannibalism

2.2 OTU豐度及多樣性指數(shù)分析

剔除肥胖軟箭蟲自身的序列, 夏季灣內(nèi)與灣口箭蟲樣品得到其有效食物序列分別為41216和33774條, 二者的OTU數(shù)量分別為47和18; 冬季灣內(nèi)與灣口箭蟲樣品有效食物序列分別為39258和40299條, 二者的OTU數(shù)量分別為56和49(表1)。OTU的數(shù)量反映了肥胖軟箭蟲攝食的種類情況, 表明夏、冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲的食物豐度大于灣口, 而夏季灣口的肥胖軟箭蟲食物豐度最低, OTU數(shù)僅為18。圖3顯示所有樣品OTU稀釋曲線都趨于飽和。讀數(shù)都在30000條以上, Alpha多樣性覆蓋率都在99.9%以上(表2)。通過測序深度曲線可判定其達(dá)到平臺期, 可認(rèn)為測樣深度涵蓋了肥胖軟箭蟲的主要食物種類。

表1 不同樣品的原始序列、高質(zhì)量序列和OTUs數(shù)

圖3 各樣品的稀釋曲線

Figure 3 Rarefaction curve of each sample

表2 不同樣品攝食物種多樣性指數(shù)

2.3 食物組成分析

大亞灣夏季和冬季灣內(nèi)、灣口的肥胖軟箭蟲的食物組成共檢測出16個門類的生物(刺胞動物門、節(jié)肢動物門、櫛水母動物門、軟體動物門、纖毛動物門、尾索動物門、線形動物門、雙鞭毛蟲門、原生動物門、子囊菌門、擔(dān)子菌亞門、球囊菌門、壺菌門、擬桿菌門、褐藻門、隱藻門)(如圖4), 其中有9個門類的生物為浮游動物, 5個門為真菌類, 2個門為浮游植物。發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)不同區(qū)域, 肥胖軟箭蟲的食物組成存在著差異: 夏季灣內(nèi)(SFeI)檢測到13個門類生物, 夏季灣外(SFeM)6個門類, 冬季灣內(nèi)(WFeI)10個門類, 冬季灣外(WFeM)9個門類。各個樣品之間生物門類水平上的豐度差異顯著, 其中刺胞動物門是肥胖軟箭蟲食物中豐度最高的門類, 占食物總量的46.16%, 其次是節(jié)肢動物門19.16%和子囊菌門14.04%。

如表3所示, 夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物中真菌占比為四組樣品中最高, 占夏季灣內(nèi)食物總豐度的55.6%(子囊菌門43.30%、擔(dān)子菌亞門12.03%); 其次是刺胞動物36.95%和軟體動物1.51%; 節(jié)肢動物只有0.33%豐度, 不及0.74%的原生動物; 極低豐度的線形動物0.01%、浮游植物(0.02%隱藻和0.06%褐藻)只出現(xiàn)在夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲的食物組成中。夏季灣口肥胖軟箭蟲幾乎只攝食浮游動物, 超過一半為櫛水母(55.25%), 其余依次是刺胞動物22.38%、節(jié)肢動物22.19%和原生動物0.06%。在冬季灣內(nèi), 肥胖軟箭蟲食物只有真菌和浮游動物兩部分, 分別為9.6%和90.4%; 浮游動物中節(jié)肢動物相對豐度最高為50.47%, 其次是刺胞動物38.61%; 與夏季灣內(nèi)占比近似的是冬季0.71%櫛水母, 而纖毛動物只在灣內(nèi)食物組成出現(xiàn)。在冬季灣外的食物組成中, 節(jié)肢動物減少到3.65%, 而刺胞動物增加到86.68%; 其余食物所占比例相比灣內(nèi)都有所下降。在生物門類的水平上, 刺胞動物門、節(jié)肢動物門、子囊菌門、擔(dān)子菌門、櫛水母動物門是18S rDNA相對食物豐度較高的5個門類。4組樣品中的刺胞動物門占比都大于20%, 刺胞動物門是大亞灣肥胖軟箭蟲的最主要食物成分。

肥胖軟箭蟲的攝食具有明顯的季節(jié)偏好性與區(qū)域偏好性, 其最主要的兩類食物是刺胞動物與節(jié)肢動物。其中刺胞動物中的珊瑚綱(Anthozoa)在冬季灣口肥胖軟箭蟲的攝食中出現(xiàn), 占食物總量的0.07%; 節(jié)肢動物中的軟甲綱(Malacostraca)在夏季灣口占1.34%, 在冬季灣內(nèi)占0.18%; 其余食物成分主要為刺胞動物中的水螅水母綱與節(jié)肢動物中的顎足綱。圖5展示了不同生物屬或種水平的水螅水母與顎足綱的豐度變化。肥胖軟箭蟲的攝食表現(xiàn)出對季節(jié)變化的響應(yīng), 夏季肥胖軟箭蟲偏好攝食更多的暖水種浮游動物, 如鉤手水母()為小型近岸水母, 廣布于淺海區(qū), 在暖水海區(qū)中密集成群, 占食物總豐度的33.3%。紡錘水蚤()也是大亞灣主要暖水種橈足類, 是夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲主要攝食的節(jié)肢動物(圖5a)。夏季灣口肥胖軟箭蟲食物主要包括櫛水母和哲水蚤, 且兩者豐度接近(圖5b); 冬季肥胖軟箭蟲捕食更多橈足類, 哲水蚤()豐度逐漸升高, 在冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲的食物譜中占比49.94%(圖5c)。肉質(zhì)介螅水母()為冬季肥胖軟箭蟲偏好攝食的水母之一(圖5d), 在冬季灣內(nèi)和灣口分別檢測出31350和73455條序列, 占對應(yīng)食物量的36.41%和85.3%。

圖4 各樣品的食物組成在生物門類的分類水平上的18S rDNA相對豐度

Figure 4 Composition of each sample food at Phylum level

表3 肥胖軟箭蟲在門分類水平的樣品食物組成

注: ND表示沒有數(shù)據(jù)。

圖 5 不同生物屬或種水平食物組成中浮游動物占比最高門類的OTU豐度圖

Figure 5 The OTU abundance of the highest phylum of zooplankton in horizontal food composition

為更直觀的體現(xiàn)不同站位的肥胖軟箭蟲攝食食物組成的差異性和相似性, 構(gòu)建了韋恩圖(圖6)。食物組成共分為243個OTUs, 4個樣品組共有食物只有3個OTUs, 藪枝螅水母(spp.)、美螅水母()、真哲水蚤()分別占食物總豐度的0.078%、0.806%和0.102%。

3 討論

毛顎類是肉食性動物, 一般認(rèn)為肥胖軟箭蟲主要捕食橈足類、枝角類, 同時攝食砂殼纖毛蟲、輪蟲和其他中小型浮游動物[18]。本次實驗在肥胖軟箭蟲的食物中沒有發(fā)現(xiàn)枝角類, 這與Kehayias等[2]在北愛琴海的研究結(jié)果有所不同, 其原因可能為本通用引物不適應(yīng)枝角類的擴增。通常認(rèn)為橈足類是其主要食物, 甚至橈足類占毛顎類食物的94.8%[19], 本研究中肥胖軟箭蟲的食性第一組成卻是水母, 其次才是橈足類、真菌和少量浮游植物。只在冬季灣內(nèi)橈足類是肥胖軟箭蟲的主要食物49.94%, 而灣口和夏季大亞灣肥胖軟箭蟲食物組成中橈足類占比都沒有超過水母(表3)。本研究中肥胖軟箭蟲攝食的水母多為沿岸暖水性小型水母, 其豐度大, 逃避能力較弱, 因而更易被捕獲。有報道[20]南海水母的物種豐富度從近岸到近海地區(qū)增加, 夏季最豐富, 冬季最小; 夏季集中在近岸海區(qū), 冬季節(jié)散落在近海海區(qū), 為肥胖軟箭蟲攝食不同水母提供了有利條件。

圖6 樣品中OTUs分布韋恩圖

Figure 6 Venn diagram showing the unique and shared OTUs in samples

本次研究中在夏季灣內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量浮游植物序列, 其可能的原因是橈足類攝食了藻類細(xì)胞, 尚未消化的橈足類被肥胖軟箭蟲攝食, 二次攝食影響肥胖軟箭蟲真實的攝食情況。在夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物譜中檢測出59.73%的真菌。在海洋生態(tài)系統(tǒng)中, 真菌是許多動植物重要的食物來源[21], 如海洋微生物壺菌是海雪的重要組成[22], 壺菌在大亞灣肥胖軟箭蟲冬季灣內(nèi)食物組成中占0.02%。本次檢測結(jié)果中, 夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲攝食真菌豐度遠(yuǎn)高于灣口, 此豐度變化與靳祖雷[23]報道的大亞灣灣內(nèi)養(yǎng)殖區(qū)真菌數(shù)量比非養(yǎng)殖區(qū)平均高89.50%相吻合。還有真菌一般營腐食性的寄生或者共生, 它們寄生在海洋植物、海洋動物的體內(nèi)以及營養(yǎng)豐富的底泥中[24], 真菌可能寄生在橈足類的體內(nèi), 也可能寄生在橈足類餌料食物體內(nèi)并隨著餌料生物被捕食進(jìn)入橈足類體內(nèi), 從而檢測到灣內(nèi)多種海洋真菌類的基因序列。紅紡錘水蚤()和住囊蟲(spp.)是已知大亞灣夏季優(yōu)勢種, 肥胖軟箭蟲在夏季灣內(nèi)更易捕食獲得, 因此夏季灣內(nèi)紡錘水蚤和住囊蟲在肥胖軟箭蟲食物組成中比其他三組樣品的高。夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲的食物多樣性在四個樣品中最高包括13個門類, 5個門類為夏季灣內(nèi)特有, 包括線形動物門、隱藻門、褐藻門、雙鞭毛蟲門、擬桿菌門。灣內(nèi)受河流影響, 高溫低鹽高營養(yǎng)鹽水使得浮游動物多樣性升高, 夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲攝食的高多樣性與夏季大亞灣豐富的浮游動物種類相關(guān)[3]。

夏季灣口櫛水母在肥胖軟箭蟲食物中占比高達(dá)55.25%, 因大亞灣夏季為西南季風(fēng)期, 粵東沿岸上升流帶來高鹽外海水[25], 同時帶來大洋暖水性生物類群櫛水母中的優(yōu)勢種球形側(cè)腕水母[26], 所以球形側(cè)腕水母可能是夏季灣口肥胖軟箭蟲的重要食物。與連喜平等[3]報道的大亞灣櫛水母種類只有球型側(cè)腕水母()一致。

在冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲攝食節(jié)肢動物的比例明顯升高, 節(jié)肢動物占食物總量的50.47%, 節(jié)肢動物門中的哲水蚤屬為冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物中的優(yōu)勢種類, 有資料表明中華哲水蚤（）只在大亞灣冬季出現(xiàn)[27]?？赡茈S著季節(jié)的改變, 肥胖軟箭蟲需要更有價值的能量進(jìn)行生殖和適應(yīng)低溫, 因而攝食更多并且更易獲得的橈足類中的哲水蚤, 這是肥胖軟箭蟲做出的季節(jié)攝食響應(yīng)和生存策略。

在冬季灣口, 源自東海的高營養(yǎng)浙閩沿岸水入侵大亞灣, 形成順時針環(huán)流, 灣口有高營養(yǎng)鹽水, 同時肉質(zhì)介螅水母是大亞灣冬季優(yōu)勢種[28], 與冬季肥胖軟箭蟲攝食高豐度的肉質(zhì)介穗水母結(jié)果(圖5)對應(yīng)。澳洲有學(xué)者研究[29]表明, 在較高鹽度條件下水母發(fā)生出芽生殖產(chǎn)生的螅狀幼體數(shù)量較多, 這給肥胖軟箭蟲提供了捕食水母螅狀幼體的良好條件。

4 結(jié)論

通過對大亞灣夏、冬季灣內(nèi)與灣口區(qū)域肥胖軟箭蟲的攝食組成分析, 發(fā)現(xiàn)肥胖軟箭蟲食物譜廣泛, 從食物中共檢測到16個門類生物, 9個門為浮游動物, 5個門屬于真菌, 2個門為浮游植物。其中水母與真菌占比遠(yuǎn)超出傳統(tǒng)攝食的認(rèn)識。其中5個門(線形動物門、隱藻門、褐藻門、雙鞭毛蟲門、擬桿菌門)為夏季灣內(nèi)特有。

大亞灣在人類活動影響較大的灣內(nèi), 尤其養(yǎng)殖區(qū)海水本身比灣口具有高豐度的真菌, 同時檢測出夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物中真菌占55.4%; 在灣口高鹽水區(qū)域, 水母是肥胖軟箭蟲的重要食物, 擬杯水母與肉質(zhì)介穗水母分別是夏季與冬季灣口肥胖軟箭蟲的主要食物。

從季節(jié)變化來看, 大亞灣夏季肥胖軟箭蟲食物多樣性明顯高于冬季, 檢測到13個門類的生物。夏季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲食物中子囊菌門貢獻(xiàn)最高(43.3%), 夏季灣口外海水帶來豐富的大洋暖水性櫛水母, 占肥胖軟箭蟲總食物豐度的55.25%; 冬季橈足類占比高于夏季, 且食物多樣性降低。冬季灣內(nèi)肥胖軟箭蟲攝食哲水蚤比例達(dá)49.94%, 而冬季灣口肉質(zhì)介穗水母占比高達(dá)85.3%。結(jié)果表明肥胖軟箭蟲的攝食具有偏好性, 且明顯存在季節(jié)和區(qū)域差異。

致謝: 感謝國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目組團(tuán)隊成員, 中國科學(xué)院南海海洋研究所黃小平研究員課題組為本實驗樣品的采集提供支持。感謝林強研究員與劉勝研究員課題組在高通量結(jié)果分析中給予的幫助。

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Dietary analysis ofbased on high-throughput sequencing technology in Daya Bay, China

Ma Jie1,2,4, Li Kaizhi2, Qiu Dajun2, Tan Yehui2, Huang Liangmin2,3*,Zhang Junbin1,4*

1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China 3. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China 4.Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresource & Eco-environmental Science, College of Life Sciences and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518000, China

In this paper, the diet ofin Daya Bay was analyzed using Illuminate High-throughput Sequencing Technology. In summer (August 2017) and winter (January 2018), the four groups of samples taken from different trawls in Daya Bay were picked up for the 18S rDNA V4 region. The sequences of the four sets of samples were obtained by high-throughput sequencing, and about 30000 high-quality sequences were obtained after processing each set of samples. The results showed that the food ofin Daya Bay originated from 16 phyla. The main dominant groups were from the three phyla of zooplankton group (46.16% cnidaria, 19.16% copepod, 14.22% ctenophore); 2 phyla of fungi (14.04% ascomycetes, 4.48% basidiomycosis); and 2 phyla of a little of phytoplankton groups (0.06% stramenopiles and 0.03% cryptophyta). In addition, a small number of ciliates, nematodes, cysticercosis, and anemones that might be ingested bywere also detected. In the summer, the weight of the neutropha in the diet of thewas the highest (43.3%) within the bay, which was related to the impact of human activities such as marine aquaculture in Daya Bay. The seawater outside the bay was rich in warm water and jellyfish, which accounted for the total food of55.25% of the degree. In the winter, the proportion of Flaccisagitta enflata feeding on Calanus was 49.94%, while in winter, the proportion of Hydractinia in the bay mouth was as high as 85.3%. The results reveal the changes in the feeding habits ofin different environments, highlighting the important role ofin the feeding process and ecosystem, and will help to understand the important role of zooplankton in the process of matter and energy transfer.

; Daya Bay; high-throughput sequencing; 18S rDNA; diet

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.02.002

SQ178.1

A

1008-8873(2021)02-009-09

2020-01-03;

2020-03-03基金項目:國家973項目(2015CB452904); 國家自然科學(xué)基金重點項目(41130855)

馬婕(1994—), 女, 碩士研究生, 主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究, E-mail: 1355472619@qq.com

黃良民, 男, 研究員, 主要從事海洋生態(tài)學(xué)研究, E-mail: hlm@scsio.ac.cn

張俊彬, 男, 教授, 海水魚類繁育生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué), E-mail: jbzhang30@163.com

馬婕, 李開枝, 邱大俊, 等. 基于高通量測序技術(shù)大亞灣肥胖軟箭蟲()的食性分析[J]. 生態(tài)科學(xué), 2021, 40(2): 9–17.

Ma Jie, Li Kaizhi, Qiu Dajun, et al. Dietary analysis ofbased on high-throughput sequencing technology in Daya Bay, China[J]. Ecological Science, 2021, 40(2): 9–17.