師希雄 岳建偉 張攀高 田 鑄 陳 騁 馬旭悅

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070)

0 引言

藏羊是我國(guó)特有的草地型藏系綿羊品種，主要分布在青藏高原及其鄰近區(qū)域。甘南藏羊包括歐拉、甘加與喬科3種類(lèi)型，其中，歐拉藏羊以產(chǎn)肉為主，肉皮毛兼用[1]，其肉的蛋白質(zhì)與能量含量高、脂肪與膽固醇含量低、礦物質(zhì)與氨基酸含量相對(duì)較高以及風(fēng)味物質(zhì)豐富[2-3]。但是，藏羊肉嫩度較低，從而影響了食用品質(zhì)。因此，有必要改善藏羊肉的品質(zhì)。

宰后肉的成熟過(guò)程是肌細(xì)胞死亡與內(nèi)部許多生化變化的過(guò)程，該過(guò)程可改善羊肉嫩度。在缺氧條件下，肌細(xì)胞死亡的方式以凋亡為主[4]。動(dòng)物宰后肌細(xì)胞代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧簇(ROS)，主要包括過(guò)氧化氫、超氧自由基、羥自由基等[5]，其中大部分ROS由線粒體中電子傳遞鏈產(chǎn)生[6]。在正常生理狀態(tài)時(shí)，活性氧的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而宰后肌細(xì)胞在缺氧應(yīng)激與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺少時(shí)，其抗氧化能力降低，部分ROS不能被清除，會(huì)破壞一系列正常的細(xì)胞信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，對(duì)肉的嫩度等品質(zhì)產(chǎn)生影響[7]。因此，ROS會(huì)對(duì)宰后肌肉的能量代謝、細(xì)胞凋亡以及嫩化產(chǎn)生影響。

文獻(xiàn)[8]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌積累過(guò)多的ROS可能會(huì)使線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)[9]研究表明，通過(guò)H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧可改善鵝肉的嫩度。文獻(xiàn)[10]也證實(shí)，在U251細(xì)胞內(nèi)由于H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS大量積累，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔增大，加劇了細(xì)胞色素C的釋放，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)[11]認(rèn)為，ROS的堆積使得線粒體氧化應(yīng)激水平提高，造成線粒體氧化損傷，從而發(fā)生凋亡，改善了牦牛肉的嫩度。但文獻(xiàn)[12]研究指出，ROS可抑制鈣激活酶的活力，不利于肉的嫩化。綜上所述，宰后H2O2處理對(duì)宰后肉嫩化的影響尚不明確，而且相關(guān)研究主要集中在豬肉、牛肉及禽肉的研究方面，關(guān)于ROS對(duì)青藏高原歐拉藏羊肉嫩化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本文采用50 mmol/L和200 mmol/L的ROS激活劑(H2O2)分別處理歐拉藏羊背最長(zhǎng)肌，在4℃條件下成熟，在成熟的不同時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、3、5、7 d)分別測(cè)定ROS相對(duì)含量、ATP含量、Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力、細(xì)胞凋亡率、肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)與肌纖維直徑，研究H2O2對(duì)宰后藏羊肉能量代謝、細(xì)胞凋亡與嫩化的影響，以期為肉品質(zhì)改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)原料及樣品處理

隨機(jī)選取10只自然放牧、健康狀況良好的4～5歲歐拉型藏羊，屠宰后迅速取背最長(zhǎng)肌(Longissimusdorsi，LD)分割成50 g左右的肉塊，再將肉塊隨機(jī)分為3組，分別用蒸餾水、50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2溶液處理，處理時(shí)按肉液比10 g/mL進(jìn)行對(duì)稱(chēng)注射。然后在4℃條件下進(jìn)行成熟，在不同成熟時(shí)間點(diǎn)(0、0.5、1、3、5、7 d)分別取樣，用于ROS及肉品質(zhì)的測(cè)定。

1.1.2試驗(yàn)儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HG101-A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，南京騰飛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海寧隆儀器有限公司；BCD-450WDS型冰箱，海爾集團(tuán)；HG200-158型插入式pH計(jì)，北京百萬(wàn)電子科技有限公司；CR-10型小型色差儀，日本KonicaMinolta公司；UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津上海有限公司；TGL-24MC型高速冷凍離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；RF 5301-PC型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

試驗(yàn)試劑：過(guò)氧化氫、戊二醛、檸檬酸鉛、甘露醇、蔗糖、無(wú)水乙醇、硫酸鋁鉀、甲醛、酒精、冰醋酸、甘油、碘酸鈉、二甲苯、蘇木清過(guò)氧化氫、多聚甲醛、醋酸雙氧鈾，均為分析純；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ROS相對(duì)含量測(cè)定

ROS相對(duì)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]的方法并稍作修改，取蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蛋白懸浮液，然后按體積比1∶1的比例將蛋白懸浮液與10 μmol/L DCFH-DA工作液(用50 mmol/L、pH值7.4磷酸鹽緩沖液配置而成)充分混合。將混合后的液體立即在37℃的水浴鍋中孵育15 min，之后將混合液離心8 min(12 000g，4℃)，再用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，ROS相對(duì)含量用每毫克蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.2.2ATP含量測(cè)定

操作步驟和計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.2.3Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力測(cè)定

操作步驟和計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.2.4細(xì)胞凋亡率測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測(cè)定。利用原位末端法(TUNEL)原理，將羊肉切成1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm的肉塊，用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，然后將羊肉組織先用石蠟包埋，再冰凍切片、脫蠟、封閉、漂洗，用熒光顯微鏡測(cè)定并計(jì)數(shù)。

1.2.5肌原纖維小片化指數(shù)(MFI)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法,并稍作修改。稱(chēng)取剔除脂肪和筋膜的肉樣,加入肉樣20倍體積的MFI緩沖液(20 mmol/L K3PO4、100 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaN3、1 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸), pH值7.1)，10 000 r/min冰浴勻漿得到肌原纖維蛋白懸濁液，并在4℃、1 000g下離心15 min，棄上清液，將沉淀繼續(xù)懸浮于20倍體積的MFI緩沖液中，重復(fù)上述步驟1次。再將肌原纖維蛋白懸浮于10 mL MFI緩沖液，然后通過(guò)200目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾。雙縮脲法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度，并將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.5 mg/mL，540 nm處測(cè)定吸光度，吸光度乘以200即為MFI。

1.2.6肌纖維直徑測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]的方法，并稍作修改。將肉樣切割成尺寸(長(zhǎng)×寬×高)為1.0 cm×0.3 cm×0.3 cm的肉塊，放入10%甲醛溶液浸泡48 h，制作石蠟切片，然后染色，中性樹(shù)膠封片后顯微拍照。然后用image-ProPlus 6.0軟件測(cè)量單根肌纖維直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行多重比較。所有指標(biāo)測(cè)定3次，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Microsoft Office Excel 2010軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中ROS相對(duì)含量的影響

ROS作為一種信號(hào)分子，在細(xì)胞中產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡如果被打破，就會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。由圖1(圖中相同時(shí)間不同字母表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)，下同)可知，H2O2處理藏羊肉0.5 d后，處理組與對(duì)照組的ROS相對(duì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，第3天時(shí)達(dá)到最大值，之后，不斷下降。第7天時(shí)，50 mmol/L H2O2處理組的ROS相對(duì)含量比對(duì)照組高39.19%(P<0.05)，可能由于H2O2作為ROS的誘導(dǎo)劑，促進(jìn)了ROS的生成。本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫處理使宰后牦牛肉成熟過(guò)程中線粒體ROS水平升高以及文獻(xiàn)[19]報(bào)道的過(guò)氧化氫處理后雞胚成肌細(xì)胞ROS水平上升相一致。由此可見(jiàn)，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，由于H2O2的誘導(dǎo)作用，使得羊肉中ROS相對(duì)含量增加，氧化應(yīng)激水平提高。

2.2 H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中ATP含量的影響

ATP既是細(xì)胞的直接供能物質(zhì)，也是維護(hù)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要來(lái)源于線粒體，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能直接影響肌肉的能量水平[20]。同時(shí)，ATP是caspases家族發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必要條件，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與ATP含量的變化密切相關(guān)[21]。從圖2看出，處理組與對(duì)照組ATP含量隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。處理后第7天時(shí)，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組ATP含量分別比對(duì)照組低25.73%和25.77%(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2處理歐拉藏羊肉導(dǎo)致了成熟過(guò)程中ATP含量的顯著降低，可能由于H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS在線粒體中大量積累，造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，抑制了ATP的產(chǎn)生[22]。文獻(xiàn)[23]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細(xì)胞經(jīng) 1 mmol/L H2O2處理后，ATP含量逐漸下降。文獻(xiàn)[24]研究表明，ROS的大量積累，導(dǎo)致電子傳遞鏈功能受損，ATP合成減少。此外，文獻(xiàn)[25]報(bào)道，H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致ATP水平和線粒體膜電位下降。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相一致。由此可知，采用H2O2處理后，宰后歐拉藏羊肉成熟過(guò)程中ATP含量顯著降低。

2.3 H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中能量代謝酶的影響

ATPase作為維持生物體正常生理代謝的重要酶系統(tǒng)，其中，Na+/K+-ATPase為維持胞外高鈉、胞內(nèi)高鉀的不均衡離子分布，通常會(huì)將胞內(nèi)的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，同時(shí)將胞外的鉀離子轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)。Ca2+-ATPase通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+，使胞漿內(nèi)游離Ca2+處于較低水平，保證細(xì)胞的正常生理功能[26]。由圖3可知，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，處理組和對(duì)照組的Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力均呈整體下降趨勢(shì)，且H2O2處理組Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，H2O2處理后第7天時(shí)，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組Ca2+-ATPase活力分別比對(duì)照組低38.39%和36.70%(P<0.05)，Na+/K+-ATPase活力分別比對(duì)照組低27.30%和29.46%(P<0.05)。結(jié)果表明，H2O2處理后，藏羊肉成熟過(guò)程中Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力顯著降低，可能由于處理后ROS相對(duì)含量增加，造成線粒體膜脂質(zhì)的破壞，從而使Na+/K+-ATPase、Ca2+-ATPase活力下降[27]。文獻(xiàn)[28]報(bào)道，經(jīng)H2O2處理2 h后的心肌細(xì)胞，Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase 活力顯著低于正常對(duì)照組。文獻(xiàn)[29]研究發(fā)現(xiàn)H2O2處理(姜黃素處理作對(duì)照)的H9c2心肌細(xì)胞，Na+/K+-ATPase活性顯著低于對(duì)照組。同時(shí)，文獻(xiàn)[30]研究表明，H2O2處理組線粒體Na+/K+-ATPase和Ca2+-ATPase活力與對(duì)照組相比均顯著降低。本試驗(yàn)結(jié)果與以上報(bào)道相似。由此可見(jiàn)，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，宰后成熟過(guò)程中由于ROS對(duì)線粒體膜的破壞，導(dǎo)致了Na+/K+-ATPase活力和Ca2+-ATPase活力顯著降低。

2.4 H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，細(xì)胞凋亡率能夠客觀地反映細(xì)胞凋亡程度[31]。從圖4可以看出，采用TUNEL法對(duì)宰后藏羊肉成熟過(guò)程中骨骼肌細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，處理組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率均隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。H2O2處理后，第3～7天時(shí)，H2O2處理組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，第7天時(shí)，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組細(xì)胞凋亡率分別比對(duì)照組高63.07%和50.42%(P<0.05)。可能因?yàn)镠2O2處理后，ROS相對(duì)含量增加，造成線粒體的氧化損傷，線粒體膜電位下降，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而使凋亡率增加[32]。文獻(xiàn)[33]研究發(fā)現(xiàn)，外源過(guò)氧化氫可引起線粒體損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，文獻(xiàn)[34]也研究表明，ROS可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果與以上報(bào)道相似。由此可見(jiàn)，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，由于ROS的增加，可能造成線粒體的氧化損傷，線粒體膜電位下降，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，凋亡率增加。

2.5 H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中MFI的影響

MFI表征肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞的情況，其大小可反映肉的嫩化程度，MFI越大，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)受破壞的程度越大，肉的嫩度也越好[35]。從圖5可以看出，處理組與對(duì)照組的MFI隨宰后時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)。H2O2處理藏羊肉0.5 d后，H2O2處理組的MFI均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。第7天時(shí)，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2處理組MFI分別比對(duì)照組高5.74%和5.19%(P<0.05)。結(jié)果表明，H2O2處理后MFI顯著升高，可能由于處理后ROS增加，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，啟動(dòng)了caspases 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行降解，破壞了肌原纖維的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MFI升高[14]。文獻(xiàn)[36]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 可促進(jìn)鈣蛋白酶的激活，有利于肌原纖維蛋白的降解。此外，文獻(xiàn)[11]報(bào)道，牦牛肉宰后成熟過(guò)程中H2O2處理組 MFI顯著高于對(duì)照組。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相似。因此，采用H2O2處理歐拉藏羊肉后，促進(jìn)了ROS的生成，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，激活了細(xì)胞凋亡酶，對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行降解，導(dǎo)致MFI增加。

2.6 宰后H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中肌纖維直徑的影響

肌纖維直徑是評(píng)價(jià)肌纖維組織學(xué)特性的指標(biāo)之一，其越細(xì)肉質(zhì)越嫩，肉品質(zhì)越好[37]。圖6反映了宰后H2O2處理對(duì)藏羊肉成熟過(guò)程中肌纖維直徑的影響，由圖6可知，隨著宰后成熟時(shí)間的增加，處理組與對(duì)照組的肌纖維直徑均呈現(xiàn)整體下降的趨勢(shì)。H2O2處理藏羊肉7d時(shí)，50 mmol/L H2O2和200 mmol/L H2O2兩個(gè)處理組肌纖維直徑分別比對(duì)照組低13.68%和13.94%(P<0.05)。結(jié)果表明，H2O2處理藏羊肉后，肌纖維直徑顯著降低，可能由于H2O2處理后，ROS增加，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而使肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致了肌纖維直徑減小，嫩度增加。該結(jié)果與文獻(xiàn)[38]報(bào)道的H2O2處理牦牛肉后嫩度提高的結(jié)果相似。總之，采用H2O2處理后，歐拉藏羊肉的肌纖維直徑顯著降低，促進(jìn)了肉嫩度的改善。此外，過(guò)氧化氫處理后ROS生成增多，可能通過(guò)攻擊多不飽和脂肪酸，導(dǎo)致風(fēng)味發(fā)生變化[39]；其次，造成凋亡的發(fā)生，可能破壞線粒體電子傳遞鏈，造成肉色的褐變[40]，同時(shí)，激活了細(xì)胞凋亡酶，可能對(duì)肌原纖維蛋白發(fā)生降解，引起質(zhì)構(gòu)的變化[41]。因此，H2O2對(duì)歐拉藏羊肉其他品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)束語(yǔ)

采用蒸餾水、50 mmol/L與200 mmol/L的過(guò)氧化氫對(duì)藏羊肉進(jìn)行處理，測(cè)定了ROS相對(duì)含量、ATP含量、Ca2+-ATPase和Na+/K+-ATPase活力、細(xì)胞凋亡率、MFI與肌纖維直徑在成熟期間的變化。結(jié)果表明，成熟7 d時(shí)，50 mmol/L和200 mmol/L處理組與對(duì)照組相比，ATP含量分別降低了25.73%和25.77%，Ca2+-ATPase活力分別降低了38.39%和36.70%，Na+/K+-ATPase活力分別降低了27.30%和29.46%，肌纖維直徑分別降低了13.68%和13.94%(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率分別提高了63.07%和50.42%，MFI分別提高了5.74%和5.19%(P<0.05)。因此，采用過(guò)氧化氫處理藏羊肉可促進(jìn)肉的嫩化。本研究可為肉品質(zhì)改善提供理論參考。