朱 穎 趙思明 王冬梅 江連洲 王中江 范志軍

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030;3.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，佳木斯 154000)

0 引言

目前，水包油型乳液被廣泛應(yīng)用于化妝品、護(hù)膚品、制藥和食品工業(yè)中。乳液是一種不穩(wěn)定的液體，乳滴易發(fā)生絮凝和聚集甚至沉降等現(xiàn)象[1]。因此，一些表面活性劑被應(yīng)用于降低界面張力并形成粘彈性保護(hù)層，從而抑制油滴的聚集[2]。蛋白質(zhì)作為一種高效的食品乳化劑，具有親水親油性質(zhì)。蛋白質(zhì)的關(guān)鍵功能特性是通過(guò)吸附至油、水兩相之間的界面處形成并穩(wěn)定乳液，從而降低界面張力、增強(qiáng)界面膜的穩(wěn)定性[3]。已有研究證明了油水界面吸收的乳蛋白層在穩(wěn)定乳液中的作用[4-5]。鷹嘴豆蛋白是具有最高彈性模量的乳化劑，可以形成較小尺寸液滴，同時(shí)提高乳液的抗氧化性[6]。蛋白質(zhì)在溶解過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)的解折疊，蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變使疏水性殘基暴露，從而改善了乳化性能[7-8]。文獻(xiàn)[9]研究了蛋白質(zhì)濃度對(duì)蛋白質(zhì)乳液性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，乳液的流變行為取決于蛋白質(zhì)的種類和濃度。蛋白質(zhì)分子的柔性差異取決于不同程度的結(jié)構(gòu)變化[10]。文獻(xiàn)[11]從蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)角度研究分子柔性與乳化性的關(guān)系。由于蛋白質(zhì)對(duì)外界環(huán)境因素具有敏感性，故會(huì)因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性差異而影響蛋白質(zhì)乳液的穩(wěn)定性[12]。因此，對(duì)蛋白乳液穩(wěn)定機(jī)理進(jìn)行深入探究有利于拓寬其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。

界面蛋白的吸附是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，蛋白分子吸附到油滴表面，形成不均一的蛋白膜。因此，界面蛋白可以在乳液中同時(shí)與油相和水相結(jié)合，包裹油滴，防止液滴聚沉，從而起到穩(wěn)定乳液的作用。研究表明，乳液中界面蛋白的含量越高，越有利于降低油水界面張力，乳液穩(wěn)定性越強(qiáng)[13-14]。界面蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是影響乳液穩(wěn)定性的重要因素，一些學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究[15-21]。蛋白質(zhì)的界面功能性表達(dá)歷經(jīng)分子吸附、結(jié)構(gòu)重排、界面擴(kuò)張等復(fù)雜過(guò)程，從蛋白質(zhì)的天然穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)難以分析界面功能性表達(dá)的構(gòu)效關(guān)系，通過(guò)柔性結(jié)構(gòu)分析、確定功能單位或結(jié)構(gòu)域可為深入解析大豆蛋白界面功能性質(zhì)提供可靠依據(jù)。

關(guān)于乳狀液穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表面活性的研究較少，迄今為止，尚未見關(guān)于乳狀液中界面蛋白柔性的相關(guān)報(bào)道。本文采用紅外光譜、紫外光譜、熒光光譜分析不同品種大豆蛋白乳液中界面蛋白的結(jié)構(gòu)特征，探究界面蛋白的柔性結(jié)構(gòu)，通過(guò)分析不同品種界面蛋白的表面疏水性、二硫鍵含量、溶解性和乳化性等，對(duì)比界面蛋白的功能性，以期解析界面蛋白的柔性結(jié)構(gòu)對(duì)功能性質(zhì)的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室自提；葵花籽油，市售；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；正己烷、乙醇、甲醇，天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海雷磁公司；電子分析天平(0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化機(jī)，德國(guó)IKA儀器設(shè)備公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司。

1.3 界面蛋白提取

將大豆分離蛋白溶解在0.05 mol/L、pH值7.5±0.1的磷酸鹽緩沖溶液中配置成1%的蛋白溶液，室溫(20℃)下攪拌2 h，然后4℃靜置充分后水和12 h。加入0.02%的疊氮化鈉，防止微生物生長(zhǎng)。按照葵花籽油與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1～1.5加入葵花籽油，然后用FJ-200型高速均質(zhì)器在20 000g下進(jìn)行5 min均勻化，然后立即在50 MPa的壓力下進(jìn)行高壓均勻化。制得的乳液用于以下研究。

界面蛋白的提取參照文獻(xiàn)[22]的方法并進(jìn)行了修改，將上述不同品種大豆蛋白乳液首先進(jìn)行10 000g離心10 min，去上層乳液層添加4倍體積去離子水進(jìn)行水洗30 min，然后20 000g高速離心20 min，取下層溶液進(jìn)行酸沉(pH值4.5)得到蛋白沉淀，然后將沉淀后的蛋白堿溶(pH值8.0)，凍干得到界面蛋白。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1界面蛋白含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定不同品種大豆蛋白乳液界面蛋白含量。將乳液樣品在室溫15 000g的條件下離心40 min，使樣品乳液分層。頂部是乳液油層，底部是蛋白水相。使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，通過(guò)文獻(xiàn)[24]方法測(cè)定底部溶液和初始蛋白溶液的蛋白濃度，界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算式為

(1)

式中CI——最初乳液中總的蛋白質(zhì)量比，g/g

Cs——上清液中的蛋白質(zhì)量比，g/g

1.4.2界面蛋白氨基酸組成測(cè)定

氨基酸組成測(cè)定參照文獻(xiàn)[25]的方法。使用Hitachi L-8800型自動(dòng)氨基酸分析儀(德國(guó)曼默博爾公司)測(cè)定氨基酸組成。在110℃下將蛋白質(zhì)樣品在密封管中用6 mol/L HCl水解24 h。水解后將溶液進(jìn)行凍干處理，復(fù)溶過(guò)濾待用。在38℃下進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為1.0 mL/min。樣品氨基酸組成用氨基酸占蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)表征。

1.4.3紅外光譜分析(FTIR)

界面蛋白的紅外光譜測(cè)定參照文獻(xiàn)[26]的方法。FTIR光譜在波長(zhǎng)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，界面蛋白研磨成粉末，并在室溫下利用KBr進(jìn)行壓片(每1 mg蛋白使用100 mg KBr)。每個(gè)光譜平均掃描60次，分辨率為2 cm-1。酰胺I帶的分析在1 700～1 600 cm-1的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由“peak fitting”軟件進(jìn)行擬合獲得。

1.4.4十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE根據(jù)文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。將溶解好的大豆分離蛋白(6 mg/mL)與上樣緩沖液混合后沸水浴5 min，3 000g離心5 min后上樣到凝膠中。濃縮膠先以80 mV進(jìn)行跑膠，然后在分離膠中以120 mV進(jìn)行電泳，直到到達(dá)凝膠底部為止。電泳完成后，將凝膠用0.05%考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色，染色時(shí)間為30 min，最后用脫色液(甲醇、冰乙酸、水，體積比1∶1∶8)洗脫至條帶清晰。使用Molecular Imager Gel Doc(美國(guó)加利福尼亞州Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)分析凝膠條帶并進(jìn)行拍攝。

1.4.5熒光光譜分析

采用F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本HITACHI公司)對(duì)樣品進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。將不同品種的SPI(大豆分離蛋白)溶液稀釋，使其質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL。光譜測(cè)定條件設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)280 nm，掃描波長(zhǎng)(Em)為300～500 nm，激發(fā)狹縫寬度(Ex Slit)為5 nm，同樣發(fā)射狹縫寬度(Em Slit)也為5 nm。重復(fù)掃描3次。

1.4.6紫外掃描

將界面蛋白溶液稀釋到0.1～0.2 mg/mL進(jìn)行紫外光譜掃描，波長(zhǎng)范圍 250～350 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率為 0.2 nm，重復(fù)掃描3次記錄平均值。

1.4.7表面疏水性分析

參照文獻(xiàn)[28]的方法，使用疏水性熒光探針8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)測(cè)定表面疏水性。在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(pH值7.0)中制備8×10-3mol/L ANS溶液和0.01 g/mL蛋白質(zhì)溶液。取5 mL蛋白溶液加入50 μL 10 mmol/L的ANS溶液。將混合物渦旋振蕩約5 s。在(20±5)℃條件下，使用Tecan M200 PRO(美國(guó)普洛麥格公司)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)為390 nm，掃描波長(zhǎng)(Em)為468 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度(Ex Slit和Em Slit)為5 nm，掃描速率(Scan spe)為10 nm/s。以熒光值為因變量，SPI質(zhì)量濃度為自變量作圖，得到的一次函數(shù)擬合線的初始斜率為表面疏水性指數(shù)。

1.4.8二硫鍵含量測(cè)定

SPI中-SH和-SS含量參照文獻(xiàn)[29]的方法測(cè)定。在0.5 mL的樣品溶液中加入2.5 mL含有8 mol/L Urea(尿素)的Tris-甘氨酸緩沖液和0.02 mL含有1% DNTB(5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸)的Tris-甘氨酸緩沖液，將其置于40℃水浴中保溫25 min。利用雙光束分光光度計(jì)(日本HITACHI公司)在412 nm處測(cè)量其吸光度。Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對(duì)照。-SH和-SS質(zhì)量摩爾濃度計(jì)算公式為

(2)

式中A412——412 nm處的吸光度

C——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL

D——稀釋因子，-SH取5.02，-SS取10

1.4.9界面蛋白溶解性測(cè)定

應(yīng)用BCA測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將含有Cu2+和BCA試劑的工作液添加到梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液(每1 mL PBS緩沖溶液中有5 mg牛血清白蛋白)及200 μL蛋白樣品的96孔板中，并于37℃保溫30 min。采用Tecan M200 PRO型酶標(biāo)儀記錄在562 nm處的吸光度，溶解度計(jì)算公式為

(3)

式中Cu——上清液蛋白質(zhì)量濃度

Ct——總蛋白質(zhì)量濃度

1.4.10界面蛋白乳化性質(zhì)測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[30]的方法，測(cè)定乳化性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)。將葵花籽油和蛋白質(zhì)溶液(0.2 mg/mL)以1∶3的體積比放入燒杯中，然后使用Ultra-Turrax T18型均質(zhì)器將其均質(zhì)化3 min。然后立即用0.1%SDS將50 μL乳液稀釋100倍。使用分光光度計(jì)(上海SHJH有限公司)記錄500 nm處和10 min后的吸光度。EAI和ESI計(jì)算公式為

(4)

(5)

式中EAI——乳化性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

L——比色皿的光路長(zhǎng)度，取1 cm

θ——乳液的油相分?jǐn)?shù)，取25%

A0、A10——乳液在0、10 min的吸光度

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次，利用SPSS Statistics軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 界面蛋白含量

前期研究[31]確定12種蛋白的柔性從大到小依次為HH-53、HN-87、HN-48、HN-44、HN-61、HN-52、HH-49、JY-55、HN-85、HN-66、HN-69、HH-51(HH代表黑河品種大豆，HN代表黑農(nóng)品種大豆，JY代表金源品種大豆)。柔性較高的蛋白以較快的吸附速率吸附到水油界面處，增加乳液中界面柔性蛋白的含量。圖1(圖中不同字母表示差異顯著，下同)顯示了不同品種蛋白乳液的界面柔性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，HH-53、HN-87、HN-48和HH-44蛋白制備的乳液含有超過(guò)50%的界面柔性蛋白，而HN-66、JY-55、HN-85和HN-61蛋白乳液含有40%～50%的界面蛋白，HN-52、HH-49和HH-51蛋白乳液中界面蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在40%左右。這說(shuō)明仍有很多未吸附的蛋白分子存在于水溶液中。柔性蛋白會(huì)增加油滴表面的吸附蛋白含量，有利于界面分子間的相互作用，從而提高乳液的穩(wěn)定性。文獻(xiàn)[32]研究表明，界面蛋白含量越高，乳液越穩(wěn)定。

2.2 界面蛋白氨基酸組成

已知大豆蛋白包含人體所需的8種必需氨基酸，界面蛋白和大豆分離蛋白的氨基酸組成差異不大。通過(guò)表1比較可知，HN-48和HN-87界面蛋白含有較多的疏水性Leu和Phe，這可能與HN-48和HN-87蛋白構(gòu)成的乳液的穩(wěn)定性有相關(guān)性。蛋白柔性較高，會(huì)導(dǎo)致含更多疏水性氨基酸的蛋白吸附在水油界面，形成穩(wěn)定的界面膜。而HN-69、HN-52和HN-61含有更多的酸性氨基酸Glu和Asp，導(dǎo)致分子間斥力增加，這可能是導(dǎo)致其界面蛋白柔性較低的原因。HN-61、HN-66、HN-69和HN-85界面蛋白的堿性氨基酸Lys顯著低于其他品種界面蛋白，這與本團(tuán)隊(duì)之前研究[31]的氨基酸分離組成對(duì)柔性蛋白的影響保持一致。柔性蛋白具有的氨基酸組成特點(diǎn)決定了柔性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[33]。文獻(xiàn)[34]研究證實(shí)疏水性和帶電性氨基酸的分布將影響蛋白質(zhì)分子的柔性，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。文獻(xiàn)[35]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論進(jìn)一步證明了課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在相鄰多肽鏈分布的疏水性和帶電荷氨基酸殘基趨向于重排并暴露在蛋白質(zhì)分子的表面。

表1 不同品種界面蛋白的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab.1 Content of different amino acids in different interface proteins %

2.3 界面蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

傅里葉紅外光譜(FTIR)是一種用來(lái)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的光譜方法[36]。不同品種界面蛋白的紅外光譜圖見圖2，采用Gauss面積法擬合對(duì)界面蛋白的酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)紅外譜圖進(jìn)行二階求導(dǎo)，可計(jì)算得出界面蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量，如表2所示。不同品種的界面蛋白均以β-折疊結(jié)構(gòu)為主，其中柔性較高的HN-87、HN-48、HH-44和HH-53界面蛋白含有較多的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和較低含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)。這4種界面蛋白所含有的柔性結(jié)構(gòu)較多，更有利于在界面處展開，穩(wěn)定乳液。文獻(xiàn)[37]研究證明，α-螺旋位于多肽鏈骨架的內(nèi)部，與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性相關(guān)，而無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)更多地與蛋白質(zhì)的柔性相關(guān)。因此，界面蛋白內(nèi)部骨架穩(wěn)定性降低，其柔性結(jié)構(gòu)增加，更有利于吸附到水油界面處。

表2 不同品種界面蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Tab.2 Secondary structure content of different interface proteins by FTIR %

2.4 界面蛋白亞基組成

不同品種界面蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析見圖3(圖中M表示標(biāo)準(zhǔn)品Marker)。大豆分離蛋白由7S和11S蛋白組成，共多個(gè)不同分子質(zhì)量的亞基。而界面蛋白的結(jié)構(gòu)組成中差異較大，部分條帶顏色深且寬，部分條帶較淺，這是由于在穩(wěn)定乳液后的蛋白中部分蛋白無(wú)法進(jìn)入電泳槽。其中HN-69、HH-49和HN-52界面蛋白條帶顏色最淺，這3種蛋白的柔性較差，因此吸附在界面處的含量較少導(dǎo)致在提取過(guò)程中含量低。也有可能是因?yàn)榻缑娴鞍自谔崛∵^(guò)程中存在少許的交叉污染[38]。經(jīng)離心后的JY-55、HH-51、HN-66、HN-85、HN-61界面蛋白組成中11S蛋白含量較高，而HH-53、HN-48、HH-44、HN-87界面蛋白中7S蛋白比重增加。7S蛋白的結(jié)構(gòu)柔性高于11S蛋白，二者的比重將影響界面蛋白的結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)而影響其功能性質(zhì)表達(dá)。

2.5 界面蛋白表面疏水性

目前研究學(xué)者認(rèn)為，蛋白質(zhì)吸附于水油界面后，蛋白質(zhì)界面層的流變性質(zhì)主要來(lái)自于疏水相互作用和二硫鍵的貢獻(xiàn)[39]。不同品種界面蛋白的表面疏水性如圖4所示，反映了界面蛋白的結(jié)構(gòu)和表面活性。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白含有較高的表面疏水性基團(tuán)，而HN-69、HN-66、HN-52和HN-61界面蛋白的表面疏水性較低，這與蛋白在水油界面的穩(wěn)定性相關(guān)。界面蛋白的折疊結(jié)構(gòu)減少，使埋藏在分子內(nèi)部的疏水性位點(diǎn)暴露出來(lái)，吸附在水油界面深入到油相內(nèi)部，形成比較牢固的蛋白膜來(lái)穩(wěn)定乳液，提高蛋白質(zhì)的乳化性能。文獻(xiàn)[40]的研究結(jié)果同樣表明，當(dāng)?shù)鞍追肿痈资嬲?，柔性較高時(shí)，其疏水性相對(duì)較高，一定程度上維持乳液的穩(wěn)定。

2.6 二硫鍵含量分析

不同品種界面蛋白的二硫鍵含量如圖4所示。二硫鍵對(duì)于穩(wěn)定蛋白質(zhì)起重要作用，一般二硫鍵數(shù)目越多，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性越強(qiáng)，柔性較差[41]。HN-87、HH-53、HN-48和HH-44界面蛋白二硫鍵含量較高，其他品種的界面蛋白也存在較大差異(P>0.05)。這是由于二硫鍵存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間。在界面蛋白吸附到油滴表面形成蛋白膜，這些蛋白質(zhì)分子間就通過(guò)二硫鍵結(jié)合，才能形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，增強(qiáng)膜的強(qiáng)度。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)中的疏水殘基多數(shù)圍繞蛋白質(zhì)中的二硫鍵形成疏水區(qū)域[42]，這也導(dǎo)致界面蛋白形成穩(wěn)定的乳液。

2.7 界面蛋白熒光光譜分析

由于蛋白分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸殘基能夠吸收發(fā)射熒光，而色氨基殘基的變化程度及其微環(huán)境情況反映了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。由圖5可以看出，不同品種大豆界面蛋白的最大吸收峰均大于330 nm，說(shuō)明所有界面蛋白的色氨酸殘基均分布在蛋白質(zhì)分子外部極性環(huán)境中。HH-51、HN-61、HN-66和HN-69界面蛋白的最大吸收峰小于330 nm，說(shuō)明這4種界面蛋白的更多色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，結(jié)構(gòu)柔性較低，不易打開暴露。HH-53、HN-52和HH-49界面蛋白的最大吸收峰位于330 nm，而HN-87、HN-85、HN-48、JY-55和HH-44界面蛋白吸收峰大于330 nm，均出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象，說(shuō)明這些界面蛋白的結(jié)構(gòu)柔性較高，更易伸展暴露，使更多的色氨酸殘基暴露在蛋白質(zhì)分子的外部，形成疏水殘基，使得界面蛋白柔性更高，更易吸附在水-油界面，防止油滴聚集，從而穩(wěn)定乳液。由于紅移的程度反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異程度，紅移程度越大，說(shuō)明蛋白質(zhì)色氨酸極性越強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性越大[43]。所以HN-48、HH-44和JY-55界面蛋白的紅移幅度更大，說(shuō)明蛋白分子結(jié)構(gòu)更加松散，結(jié)構(gòu)柔性更強(qiáng)，更易暴露內(nèi)部的氨基酸殘基。這與界面蛋白表面疏水性的結(jié)果一致。

2.8 界面蛋白紫外-可見吸收光譜

紫外-可見吸收光譜是一種非常簡(jiǎn)單、實(shí)用的，用于探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法。由于蛋白質(zhì)側(cè)鏈含有的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基等芳香族氨基酸，會(huì)產(chǎn)生不同的紫外吸收峰，從而反映蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象的變化[44]。由圖6可知，界面蛋白在290 nm左右處出現(xiàn)了峰值。HN-69、HN-61、HH-51和HH-44界面蛋白的峰值低于其他品種的界面蛋白，界面蛋白發(fā)生了紅移，說(shuō)明蛋白質(zhì)中的酪氨酸更多地暴露于極性環(huán)境中，而色氨酸更多地趨向于埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部。

2.9 界面蛋白溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性與乳化性質(zhì)有著密切關(guān)系，不同品種界面蛋白的溶解性如圖7所示。12種界面蛋白的溶解性較差，且具有顯著性差異(P<0.05)。由于界面的提取是從蛋白質(zhì)乳液中分離得到的，含有少部分的油脂殘存。另外，界面蛋白的結(jié)構(gòu)特征表明，界面蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且含有較多的疏水性氨基酸，使得溶解性降低。這與上述對(duì)界面蛋白的表面疏水性的分析結(jié)果相同。

2.10 界面蛋白乳化性質(zhì)

柔性較高的HN-87、HH-44、HH-53和HN-48界面蛋白表現(xiàn)出更好的界面性質(zhì)(圖8)。不同品種界面蛋白的乳化穩(wěn)定性差異不大，較分離蛋白相比有所降低。這可能是由于界面提取后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，在穩(wěn)定蛋白膜上失去了原本穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致乳化穩(wěn)定性降低。對(duì)比前期對(duì)大豆分離蛋白的乳化性質(zhì)的測(cè)定[31]，進(jìn)一步確定界面蛋白是柔性最高的柔性蛋白，表面擁有較高的疏水性基團(tuán)，有利于吸附在水油界面，增加蛋白質(zhì)分子間的相互作用。文獻(xiàn)[45]的研究結(jié)果表明，表面疏水性是影響分析蛋白質(zhì)乳化性質(zhì)的主要參數(shù)，本文研究結(jié)果與其相吻合。結(jié)合上述界面蛋白結(jié)構(gòu)特征的分析，可以確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變會(huì)極大影響界面學(xué)性質(zhì)。

3 結(jié)束語(yǔ)

探究了不同品種大豆界面蛋白的結(jié)構(gòu)特征和界面學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：柔性蛋白更易吸附到水油界面，且增加界面蛋白的吸附量，形成的乳液穩(wěn)定性增加。這與其氨基酸組成存在相關(guān)性，疏水性氨基酸含量決定了柔性界面蛋白與水分子的相互作用，與表面疏水性呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。界面蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較低，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加。界面蛋白中7S亞基的柔性較高。紫外光譜和熒光光譜分析表明，柔性界面蛋白分子的結(jié)構(gòu)易伸展，使內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，且界面蛋白分子的二硫鍵多在疏水基團(tuán)附近形成，從而降低了界面蛋白的溶解性，增加其界面學(xué)性質(zhì)。