燕麗君, 佟勝全, 劉 靜, 高冬梅, 陳南芳, 胡 杰

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北 唐山 063000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA） 是一種病因未明、慢性和炎癥性的自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)軟骨及骨的損害，常累及手、足大小關(guān)節(jié)，嚴(yán)重可造成關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，在RA 的病變過(guò)程中，抗炎/促炎反應(yīng)的失衡和滑膜細(xì)胞凋亡障礙是影響患者免疫、炎癥及關(guān) 節(jié) 骨 組 織 損 傷 的 重 要 因 素［1-3］。研 究［4-6］顯 示：Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是免疫炎癥損傷的重要通路，TLR4 的下游信號(hào)分子主要包括NF-κB，被激活的NF-κB 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)多種基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白 細(xì) 胞 介 素6 （interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等炎性因子的釋放，因此，可通過(guò)負(fù)調(diào)控TLR4/NF-κB 通路，調(diào)節(jié)全身免疫炎癥反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的凋亡、減少破骨細(xì)胞分化，從而減輕炎癥和關(guān)節(jié)軟骨與骨組織的侵蝕。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是一種存在于白芍干燥根中的混合物，其成分包括羥基芍藥苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥花苷等，研究［7］顯示：TGP 具有減輕炎癥反應(yīng)、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)及抗應(yīng)激等作用，已廣泛應(yīng)用于RA 的臨床治療實(shí)踐中。LI 等［8］研究發(fā)現(xiàn)：TGP 能有效地改善膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型小鼠的炎癥和關(guān)節(jié)損傷，通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 信號(hào)通路降低血清免疫球蛋白G2a（immunoglobulin G2a，IgG2a）和促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素21（interleukin-21，IL-21）、TNF-α 和IL-6的產(chǎn)生，降低NF-κB p65和STAT3的磷酸化，呈劑量依賴(lài)性。JIA 等［7］研究發(fā)現(xiàn)：TGP 可通過(guò)調(diào)節(jié)CIA 大鼠的G 蛋白，抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的增殖。然而關(guān)于TGP 介導(dǎo)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)RA 大鼠影響的相關(guān)研究較少，因此，本研究構(gòu)建CIA 模型，探究TGP 介導(dǎo)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)RA 大鼠的作用及其機(jī)制，為T(mén)GP 的臨床應(yīng)用及其RA 的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器健康雄性SPF級(jí)SD 大鼠60 只，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2019-0004，10～12 周齡，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。對(duì)全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，于室溫23 ℃～25 ℃，濕度30%，正常晝夜節(jié)律，予以自由進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且在動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督下執(zhí)行。牛Ⅱ型膠原蛋白溶液和完全弗氏佐劑購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司，TGP 購(gòu)于寧波立華制藥有限公司，大鼠TNF-α、 IL-6 和IL-1β ELISA 試劑盒購(gòu)于上海斯信生物科技有限公司，RNA 提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于大連寶生物工程有限公司，PCR 引物由美國(guó)Invitrogen 公司設(shè)計(jì)，BCA 試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司；NF-κB p65、TLR4、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 3 （cysteinyl aaspartate specific proteinase-3，caspase-3）、活化的caspase-3（Cleaved caspase-3）、B 細(xì) 胞 淋 巴 瘤2 （B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和β-actin 抗 體 購(gòu) 于 美 國(guó) Cell Signaling Technology 公司。大鼠足踝體積測(cè)量?jī)x購(gòu)于成都泰盟科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建全部大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（10 只） 和CIA 模型組（50 只）。參照參考文獻(xiàn)［9］建立CIA 大鼠模型，將1g·L－1牛Ⅱ型膠原蛋白溶液與等體積的完全弗氏佐劑乳化混合，在4 ℃中形成穩(wěn)定的乳劑，保存?zhèn)溆谩IA 模型組大鼠予以0.1 mL 乳劑進(jìn)行右后足跖下區(qū)皮下注射。在第14 天，再次注射0.1 mL乳化劑免疫。對(duì)照組大鼠在同一位置注射等量的生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理第15 天，取建模成功的SD 大 鼠40 只， 隨 機(jī) 分 為CIA 組、 低 劑 量（25 mg·kg－1） TGP 組（TGP-LD 組）、中 劑 量（50 mg·kg－1） TGP 組（TGP-MD 組）和高 劑 量（100 mg·kg－1）TGP 組（TGP-HD 組），每組10 只大鼠，不同劑量TGP 組治療方法參照文獻(xiàn)［7］灌胃方法，從第15 天到第35 天對(duì)CIA 大鼠灌胃給予TGP。對(duì)照組和CIA 組大鼠灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水。治療結(jié)束后，利用40 mg·kg－1戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，于－80 ℃條件下保存用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)，并脫頸處死大鼠，取滑膜組織，于－80 ℃條件下保存，用于實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR （Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）和Western blotting法檢測(cè)。

1.4 大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度檢測(cè)

體質(zhì)量：每隔7 d 測(cè)量大鼠體質(zhì)量。關(guān)節(jié)炎指數(shù)［10］：0 分，腫脹和局部發(fā)紅；1 分，踝關(guān)節(jié)存在輕微的紅腫；2 分，整個(gè)足爪有輕度腫脹及紅腫；3 分，全爪中度紅腫及發(fā)炎；4 分，全爪重度紅腫，甚至腳掌畸形或僵直，四肢分開(kāi)計(jì)分，大鼠4 個(gè)足爪的累積評(píng)分作為多關(guān)節(jié)炎指數(shù)，其最大值為16。關(guān)節(jié)炎指數(shù)越高則表示腫脹越嚴(yán)重。關(guān)節(jié)腫脹度：通過(guò)大鼠足踝體積測(cè)量?jī)x利用排水法測(cè)定大鼠雙后足踝體積變化情況，每隔7 d 測(cè)定1 次。關(guān)節(jié)腫脹度=造模后同側(cè)足踝體積－造模前同側(cè)足踝體積。

1.5 ELISA 法檢測(cè)血清炎癥因子水平按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平。

1.6 RT-qPCR 法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中相關(guān)基因表達(dá)通過(guò)RNA 提取試劑盒對(duì)大鼠滑膜組織中RNA 進(jìn)行提取。取1 μg RNA，用AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR 引物見(jiàn)表1。以β-actin 作為內(nèi)參。PCR 擴(kuò)增條件參數(shù)設(shè)置為預(yù)變性94 ℃，5 min，變性94 ℃，40 s，退火60 ℃，40 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。采用2－ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)水平。

表1 PCR 引物序列Tab. 1 Primer sequences of PCR

1.7 Western blotting 法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組中相關(guān)蛋白表達(dá)水平提取關(guān)節(jié)滑膜組織蛋白，按BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)組織中的蛋白濃度，予以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，PVDF 轉(zhuǎn)膜，5% BSA 室溫封閉1 h，加入一抗NF-κB p65（1∶1 000 稀釋?zhuān)⒁豢筎LR4 （1∶1 000 稀釋?zhuān)?、?抗caspase-3 （1∶1 000 稀 釋?zhuān)⒁?抗Cleaved caspase-3（1∶10 00 稀釋?zhuān)?、一抗Bax（1∶1 000 稀釋?zhuān)?、一抗Bcl-2（1∶1 000 稀釋?zhuān)?和一抗β-actin（1∶3 000 稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜。漂洗，每次5 min，再加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，洗膜，3 次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。以β-actin 作為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin 條帶灰度值比值表示目的蛋白條帶表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0 和Graph Pad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平，關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度明顯升高（P＜0.05）；與CIA 組比較，不同劑量TGP 組大鼠體質(zhì)量明顯升高，關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度Fig.1 Body weights, arthritis indexes and joint swelling degrees of rats in various groups

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β水平與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯升高（P＜0.05）；與CIA 組比較，不同劑量TGP 組大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.05）；與TGP-LD 組比較，TGP-MD 組和TGP-HD 組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 mRNA 及蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Cleaved caspase-3和Bax mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與CIA 組比較，不同劑量TGP 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Cleaved caspase-3 和Bax mRNA 及其蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與TGP-LD組比較，TGP-MD 組和TGP-HD 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Cleaved caspase-3 和Bax mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表2、表3 和圖2。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平Tab. 1 Levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum of rats in various groups [n=10，±s，ρB/(ng·L－1）]

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平Tab. 1 Levels of TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum of rats in various groups [n=10，±s，ρB/(ng·L－1）]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with CIA group；#P＜0.05 compared with TGP-LD group.

IL-1β 21.17±1.29 68.35±9.63*57.68±6.26△42.44±5.03△#37.29±2.51△#Group Control CIA TGP-LD TGP-MD TGP-HD TNF-α 49.31±4.82 107.63±16.29*79.26±8.20△64.11±7.13△#58.20±5.61△#IL-6 28.64±3.06 83.43±10.02*64.57±7.79△60.32±7.25△#42.64±5.87△#

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of Cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA in joint synovial tissue of rats in various groups（n=10,±s）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of Cleaved caspase-3,Bax and Bcl-2 mRNA in joint synovial tissue of rats in various groups（n=10,±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with CIA group；#P＜0.05 compared with TGP-LD group.

Group Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 1.00±0.02 0.41±0.05*0.56±0.07△0.75±0.04△#0.86±0.06△#1.01±0.03 2.95±0.24*2.46±0.17△2.07±0.15△#1.69±0.18△#Control CIA TGP-LD TGP-MD TGP-HD 0.99±0.04 0.35±0.05*0.54±0.07△0.63±0.05△#0.82±0.09△#

2.4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與CIA 組比較，不同劑量TGP 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與TGP-LD組比較，TGP-MD組和TGP-HD 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA 及其蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），且具有劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表4 和圖3。

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 proteins in joint synovium tissue of rats in various groups （n=10,±s）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Tab. 3 Expression levels of Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 proteins in joint synovium tissue of rats in various groups （n=10,±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with CIA group；#P＜0.05 compared with TGP-LD group.

Group Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3 0.63±0.05 0.38±0.04*0.47±0.06△0.60±0.09△#0.69±0.12△#0.82±0.07 1.98±0.32*1.67±0.21△1.34±0.16△#0.97±0.12△#Control CIA TGP-LD TGP-MD TGP-HD 0.66±0.08 0.26±0.04*0.41±0.02△0.47±0.04△#0.56±0.07△#

圖2 各大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Cleaved caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of Cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 proteins in joint synovium tissue of rats in various groups

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of TLR4,NF-κB p65 mRNA and protein in joint synovium tissue of rats in various groups（n=10,±s）

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab. 4 Expression levels of TLR4,NF-κB p65 mRNA and protein in joint synovium tissue of rats in various groups（n=10,±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with CIA group；#P＜0.05 compared with TGP-LD group.

NF-κB p65 protein 0.31±0.04 0.78±0.06*0.63±0.05△0.55±0.05△#0.35±0.04△#Group Control CIA TGP-LD TGP-MD TGP-HD TLR4 mRNA 1.01±0.03 3.65±0.38*3.18±0.29△2.74±0.20△#1.73±0.15△#NF-κB p65 mRNA 1.00±0.05 2.78±0.21*2.25±0.23△1.98±0.17△#1.36±0.11△#TLR4 protein 0.52±0.08 1.02±0.11*0.89±0.08△0.77±0.05△#0.48±0.04△#

圖3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 3 Electrophoregram expressions of TLR4 and NF-κB p65 proteins in joint synovium tissue of rats in various groups

3 討 論

RA 病理機(jī)制復(fù)雜多樣，中醫(yī)認(rèn)為其病理機(jī)制可能因寒濕外邪入侵，致使氣血失調(diào)及臟腑虧損，久病不愈則氣血不暢，造成寒濕凝滯，引發(fā)關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及疼痛等癥狀［11］。白芍作為芍藥的干燥根，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗和柔肝止痛等作用，白芍的主要活性成分屬于糖苷類(lèi)物質(zhì)，被稱(chēng)作TGP，TGP 具有鎮(zhèn)痛、抗炎及調(diào)節(jié)自身免疫反應(yīng)等藥理作用［12］；研究［7］表明：TGP 治療CIA大鼠，癥狀改善效果較好，可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮抗炎作用，認(rèn)為T(mén)GP 有可能成為治療CIA 的潛在藥物。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹程度均顯著升高，體質(zhì)量明顯降低，表明CIA 模型可引發(fā)大鼠關(guān)節(jié)腫脹和關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)；此外，不同劑量TGP 均可明顯減輕大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及關(guān)節(jié)腫脹程度，并使大鼠體質(zhì)量恢復(fù)趨近正常水平，且呈劑量依賴(lài)性。表明TGP 可有效改善CIA 模型大鼠臨床癥狀，其機(jī)制可能與TGP 通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化、減輕大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥、抑制滑膜細(xì)胞的過(guò)度增殖及促進(jìn)其凋亡有關(guān)［13-14］。

TLR 作為一類(lèi)對(duì)天然免疫的細(xì)胞表面信號(hào)具有啟動(dòng)作用的傳導(dǎo)受體蛋白，在自身免疫疾病進(jìn)展中起著重要作用，其于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及免疫細(xì)胞表面上廣泛表達(dá)，與自身免疫疾病、慢性炎癥及腫瘤疾病發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)［15-16］。TLR4 可通過(guò)連接蛋白MyD88 依賴(lài)或其非依賴(lài)信號(hào)途徑對(duì)NF-κB 活化產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)，促進(jìn)TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎性介質(zhì)的合成與釋放，參與RA 疾病的發(fā)生發(fā)展［17］。而炎癥反應(yīng)是RA 發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一，研究［18］顯示：RA患者血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎性因子均呈高水平表達(dá)。IL-6屬于一種促炎因子，能通過(guò)上調(diào)IL-1β 和TNF-α 水平，導(dǎo)致肝臟生成類(lèi)風(fēng)濕因子［19］。IL-1β能對(duì)滑膜及軟骨細(xì)胞分泌的金屬蛋白酶和機(jī)制溶素產(chǎn)生刺激作用，進(jìn)而損傷軟骨基質(zhì)［20］。本研究結(jié)果顯示：CIA 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 呈高水平表達(dá)，且予以TGP 治療后，大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4 和NF-κB p65 表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活參與RA 疾病的發(fā)生發(fā)展，且TGP 對(duì)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化具有抑制作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達(dá)水平明顯升高，說(shuō)明CIA 模型可加劇大鼠的炎癥反應(yīng)；與CIA 組比較，不同劑量組大 鼠 血 清 中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水 平 明 顯 降 低，說(shuō)明TGP 通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化進(jìn)而減輕了大鼠的炎癥反應(yīng)。

TLR4/NF-κB 信號(hào)通路被活化后除了促進(jìn)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄外，還對(duì)許多纖維相關(guān)因子的基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)滑膜細(xì)胞的大量增殖，造成滑膜成纖維細(xì)胞的凋亡不足，而細(xì)胞凋亡不足已成為誘發(fā)多種自身免疫性疾病的重要因素之一［6］。因此，抑制關(guān)節(jié)滑膜組織異常增生可作為治療RA 的重要手段。caspase-3 屬于caspase 家族中主要的細(xì)胞凋亡，caspase-3 通過(guò)自身裂解活化后形成Cleaved caspase-3，即Cleaved caspase-3 為Caspase-3 的活化形式，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Cleaved caspase-3 可誘導(dǎo)多種蛋白或酶類(lèi)失活，引發(fā)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能改變，致使DNA 修復(fù)異常及細(xì)胞周期阻滯，加速細(xì)胞凋亡；Bcl-2 作為一種抗細(xì)胞凋亡因子，其可明顯抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其存活；Bax 作為一種促凋亡基因，可加速細(xì)胞凋亡［21-22］。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，CIA 組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Bcl-2 表達(dá)水平升高，Cleaved caspase-3 和Bax 表達(dá)水平降低，說(shuō)明CIA 模型可抑制大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖；此外，TGP 治療后可使上述凋亡相關(guān)因子表達(dá)與之呈相反趨勢(shì)。說(shuō)明TGP 治療后可促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，對(duì)RA 起保護(hù)作用，其作用機(jī)制與TGP 抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化有關(guān)。

綜上所述，CIA 大鼠體質(zhì)量較輕、關(guān)節(jié)較為腫脹，不同劑量TGP 治療均可改善CIA 大鼠的炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡，其中100 mg·kg－1TGP 作用效果更為顯著，其作用機(jī)制與TGP 抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化有關(guān)。本研究結(jié)果為尋求一種RA 的新型治療手段提供了理論依據(jù)。