趙展琦, 張程錦, 田 娟

（錦州醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室, 遼寧 錦州 121001）

鐵是機體必需的金屬離子之一，參與眾多生命過程［1-2］。腦鐵屬于非血紅素鐵，參與腦內(nèi)許多重要的生物代謝過程［3-4］。腦鐵受到嚴(yán)格調(diào)控，鐵代謝異常會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常［5-6］。研究［7］表明：隨著年齡增長，腦鐵含量不斷增加。細(xì)胞內(nèi)鐵含量過高可引起氧化應(yīng)激增強、蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞死亡，甚至導(dǎo)致某些神經(jīng)退行性疾?。?-11］。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧分子（reactive oxygen species，ROS）可誘導(dǎo)細(xì)胞啟動內(nèi)源性凋亡通路，使線粒體膜電位下降、膜通透性增高，細(xì)胞色素C 被釋放到胞漿與凋亡酶激活因子結(jié)合，激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）級聯(lián)的凋亡通路，造成細(xì)胞DNA損傷，引起細(xì)胞凋亡或壞死［12］。B細(xì)胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）同屬Bcl-2 家族。其中，Bcl-2 屬于抑凋亡基因家族，能夠抑制細(xì)胞凋亡；Bax 屬于促凋亡基因家族，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。

Nedd4家族反應(yīng)蛋白 1 （Nedd4 family interacting protein 1， Ndfip1） 是一種進(jìn)化保守的跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)多種靶蛋白發(fā)生泛素化降解［14-16］。本課題組前期研究［17］顯示：鐵超載可引起神經(jīng)細(xì)胞生存率明顯下降；而Ndfip1 過表達(dá)可提高鐵超載條件下神經(jīng)細(xì)胞的生存率，具有保護(hù)作用。進(jìn)一步研究［18］發(fā)現(xiàn)：Ndfip1 對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能是通過降低神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)二價金屬離子轉(zhuǎn)運蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）表達(dá)和轉(zhuǎn)鐵能力，減少鐵離子進(jìn)入細(xì)胞，減輕細(xì)胞內(nèi)鐵聚集實現(xiàn)的。目前，有關(guān)Ndfip1 減輕鐵離子誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機制尚不清楚。本研究通過觀察鐵超載條件下Ndfip1 過表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)ROS 水平和凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax 以及凋亡終末執(zhí)行酶caspase-3 表達(dá)的影響，探討Ndfip1 對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用機制，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)鐵代謝紊亂相關(guān)疾病的臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y 細(xì)胞（南京科佰生物技術(shù)有限公司）。Ndfip1質(zhì)粒（上海吉凱基因科技有限公司），兔抗Bcl-2 抗體、兔抗Bax 抗體和兔抗caspase-3 抗體（美國Santa Cruz 公司），小鼠GAPDH 單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 和辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），PVDF 膜、蛋白Marker 和ECL 發(fā)光試劑盒（上海天能科技有限公司），LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen 公司），胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基和胰蛋白酶（南京金斯瑞生物科技有限公司），ROS 檢測試劑盒（上海翊圣生物技術(shù)有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（上海力新儀器有限公司），Olympus倒置相差顯微鏡（南京伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司），熒光顯微鏡（上海寰熙醫(yī)療器械有限公司），生物安全柜（廣州沃霖實驗室設(shè)備有限公司），低溫離心機（德國艾本德公司），超聲波細(xì)胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），電泳儀、濕轉(zhuǎn)印電泳槽和凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），恒溫水浴箱（上海森信實驗儀器有限公司），分光光度計（南京菲勒儀器有限公司），超低溫冰箱（美國Thermofisher 公司），水平搖床和電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)液氮中取出凍存細(xì)胞，迅速放入37 ℃～40 ℃水浴融化，吸至培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），置于培養(yǎng)箱 （37 ℃、5% CO2、100% 濕度） 中培養(yǎng)、傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞分組將細(xì)胞以2×105mL－1細(xì)胞密度接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，換無血清無抗生素培養(yǎng)液，待細(xì)胞達(dá)到80%融合；取1.5 μL LipofectamineTM2000 用無血清無抗生素培養(yǎng)液稀釋至75 μL，同時取0.6 μg 的質(zhì)粒用無血清無抗生素培養(yǎng)液稀釋至75 μL，分別混勻后，室溫靜止5 min；將兩者混勻，室溫靜止30 min；將12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞用無血清無抗生素培養(yǎng)液清洗3 次，加入300 μL 無血清無抗生素培養(yǎng)液，然后將LipofectamineTM2000-DNA 混合物逐滴加入；37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，換為含血清、抗生素的常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h?？召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y 細(xì)胞為對照組，Ndfip1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y 細(xì)胞為實驗組。

1.4 金屬離子處理將細(xì)胞制成懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105mL－1并接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板；待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液置換成無血清無抗生素培養(yǎng)液；加入硫酸亞鐵（FeSO4）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 MTT 法檢測細(xì)胞生存率在每孔加入20 μL 0.5% MTT 溶液培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，將150 μL 二甲基亞砜（DMSO）滴入孔內(nèi)，放搖床上低速振蕩30 s，直至結(jié)晶物充分溶解，分光光度計檢測吸光度（A）值，計算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=（實驗組A 值-空白組A 值）/（對照組A 值-空白組A 值）×100%。

1.6 ROS 水平檢測ROS 檢測試劑盒是一種基于2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光強度變化、定量檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的最常用方法。DCFH-DA 本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可被酯酶水解成DCFH。DCFH 被細(xì)胞內(nèi)ROS 氧化成2'，7'-二氯熒光素（DCF），DCF 可發(fā)出綠色熒光且不能穿透細(xì)胞膜。綠色熒光強度與ROS 的水平成正比。具體步驟：取DCFH-DA 用無血清無抗生素培養(yǎng)液稀釋（1∶1 000） 至終濃度10 μmol·L－1；金屬離子處理細(xì)胞后，棄培養(yǎng)液；加入100 μL 稀釋好的DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)30 min；用無血清無抗生素培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞2 次；熒光顯微鏡下觀察、拍照保存。以熒光強度表示ROS 水平。

1.7 丙 二 醛（malonyldialdehyde，MDA）水 平 檢測機體產(chǎn)生的氧自由基可攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，形成脂質(zhì)過氧化物，如MDA 等，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。因此，通過測定細(xì)胞內(nèi)MDA 水平，可了解其脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞損傷的情況，實驗具體操作可按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 Western blotting 法檢測細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平取金屬離子處理后細(xì)胞，4 ℃PBS 緩沖液沖洗3 次，加入1 mL、4 ℃PBS 緩沖液輕輕刮取細(xì)胞，移至離心管，1 000 r·min－1低溫離心5 min，棄上清，加入蛋白裂解液，4 ℃裂解2 h，12 000 r·min－1低溫離心30 min，考馬斯亮藍(lán)法對上清液進(jìn)行蛋白定量。取50 μg 待測蛋白與十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗Bcl-2 抗體（1∶200） 或兔抗Bax 抗 體 （1 ∶200） 或兔抗 caspase-3 抗體（1 ∶150）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h， ECL 法檢測蛋白條帶，將條帶掃描后采用Photoshop 7.0 軟件進(jìn)行處理。內(nèi)參為GAPDH。掃描X 射線片，計算機處理，應(yīng)用公式計算A值，A值=－lgT，T 為透光率，A值越大，表示密度越大，蛋白表達(dá)水平越高。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。2 組細(xì)胞生存率、細(xì)胞中MDA 水平以及細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗，均符合正態(tài)分布，以-±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2 組細(xì)胞生存率對照組細(xì)胞生存率為（63.5±5.2）%，實驗組細(xì)胞生存率為（88.3±7.7）%，實驗組細(xì)胞生存率明顯高于對照組（P＜0.05）。

2.2 2 組細(xì)胞中ROS 水平與對照組比較，實驗組細(xì)胞中熒光強度明顯減弱，說明ROS 水平降低。見圖1。

2.3 2 組細(xì)胞中MDA 水平實驗組細(xì)胞中MDA水 平（0.41 μmol·g－1±0.14 μmol·g－1）低于對照組（0.53 μmol·g－1±0.15 μmol·g－1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 2 組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平與對照組 （100.0±8.5、 108.0±4.2 和105.0±3.3）比較，實驗組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平（132.6±7.6）明顯升高（P＜0.05），Bax 蛋白表達(dá)水平（78.3±10.5）明顯降低（P＜0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)水平（61.4±9.5）明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1 鐵超載條件下2 組細(xì)胞中ROS 水平(DCFH-DA,×400)Fig.1 Levels of ROS in cells in two groups under iron overload condition (DCFH-DA，×400)

圖2 2 組細(xì)胞中Bcl-2、Bax 和caspase-3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 proteins in cells in two groups

3 討 論

機體正常組織在氧化代謝過程中會產(chǎn)生少量自由基，這些自由基會被自由基酶清除以維持機體的平衡和穩(wěn)定。但如果機體處于某些損傷因素作用下，細(xì)胞內(nèi)的氧化代謝增強或細(xì)胞自身抗氧化能力減弱，就會造成ROS 過量增加甚至堆積，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。這種氧化和抗氧化的失衡狀態(tài)稱為氧化應(yīng)激。機體有氧代謝過程中產(chǎn)生的ROS 族包括O2-、H2O2、OH、HOCl、NO、O3和單線態(tài)氧等。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平就會升高，機體抗氧化系統(tǒng)沒有能力清除時，會對機體造成損害，從而引起細(xì)胞功能紊亂。另外，氧化應(yīng)激使機體處于易損狀態(tài)，增強了致病因素對機體的毒性作用，甚至引起基因突變。在自由基中，ROS 具有很強的生物活性，易與生物大分子反應(yīng)，通過一系列過氧化還原反應(yīng)，引起細(xì)胞發(fā)生生物結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞內(nèi)鐵含量過高，可引起氧化應(yīng)激增強，產(chǎn)生大量ROS。大量ROS 可誘導(dǎo)細(xì)胞啟動內(nèi)源性凋亡通路，造成線粒體膜的損傷，即線粒體出現(xiàn)膜電位下降和膜通透性增高。線粒體膜損傷會引起細(xì)胞色素C 的釋放，并與凋亡酶激活因子結(jié)合，從而激活caspase 級聯(lián)的凋亡通路，造成細(xì)胞DNA 損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死［12］。本研究結(jié)果顯示：Ndfip1 過表達(dá)能減少神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。這一結(jié)果也解釋了本課題組前期的研究［19］發(fā)現(xiàn)，即Ndfip1 過表達(dá)能減輕鐵超載造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞生存率。

Bcl-2 和Bax 同屬Bcl-2 家族。其中，Bcl-2 屬 于抑凋亡基因家族，能夠抑制細(xì)胞凋亡；Bax 屬于促凋亡基因家族，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13，20］。Bcl-2 含有4 個Bcl-2 同源性結(jié)構(gòu)域（BH1～BH4）和1 個疏水性羧基末端，能將Bcl-2 蛋白靶向線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即Bcl-2 蛋白定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核周膜；Bax 通常位于胞漿，在凋亡信號誘導(dǎo)下可很快遷移到線粒體，呈現(xiàn)高分散的亞細(xì)胞定位［20］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Bcl-2 家族蛋白通過成員間的異二聚化、磷酸化和蛋白水解等方式，最終定位于線粒體膜引起膜通透性的改變［13］。氧化應(yīng)激與Bcl-2 家族關(guān)系密切。Bcl-2 本身并不是一種抗氧化劑，其作為一種氧化原對細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化能力增強，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（gluthathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等酶活性升高，從而阻止細(xì)胞凋亡［21-23］。caspase 家族蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，其中caspase-3 是凋亡過程中最主要的終末執(zhí)行酶，其底物包括DNA 片段因子等功能蛋白質(zhì)，參與DNA 修復(fù)、mRNA 裂解、固醇生物合成、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白剪切和細(xì)胞骨架重建［24-25］。本研究結(jié)果顯示：跨膜蛋白Ndfip1 過表達(dá)可使人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高，Bax 蛋白表達(dá)水平降低，caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低，說明Ndfip1能夠抑制鐵超載誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。而且，Ndfip1 的這種保護(hù)作用是通過線粒體途徑實現(xiàn)的。

綜上所述，Ndfip1 過表達(dá)可減輕神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵超載誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。目前，Ndfip1 相關(guān)研究報道不多，其主要功能和作用機制尚未十分清楚。但Ndfip1 在機體各器官的鐵代謝平衡過程中發(fā)揮的作用不容忽視，Ndfip1 在腦鐵代謝平衡及鐵代謝紊亂相關(guān)疾病中的重要作用尚需進(jìn)一步研究。