白 雪, 于 露, 楊文強, 何 鑫, 楊新生, 楊 菁

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2. 錦州衛(wèi)生學(xué)校外科教研室，遼寧 錦州 121001）

肌肽是一種內(nèi)源性的水溶性二肽，由組氨酸和丙氨酸組成，存在于人體肌肉和腦組織中，具有神經(jīng)保護作用［1］。研究［2-4］表明：肌肽對糖尿病及缺血再灌注引起的認知功能障礙均具有保護作用，其機制可能與肌肽抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減少核轉(zhuǎn)錄因 子κB （nuclear transcription factor-κB，NF-κB）向核內(nèi)轉(zhuǎn)移、下調(diào)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白 細 胞 介 素1β （interleukin-1β，IL-1β）的表達進而抑制炎癥有關(guān)。星形膠質(zhì)細胞（astrocyte， AS） 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、體積最大和分布最廣的一種神經(jīng)細胞［5］。炎癥與AS 的激活密切相關(guān)，活化的AS 可釋放IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子引起神經(jīng)炎癥［6-7］。因此，抑制AS 過度激活及其炎癥過程是消除神經(jīng)炎癥作用的關(guān)鍵，而肌肽對AS 激活的影響未見報道。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性細菌細胞壁的主要組成成分，是一種作用強的致炎因子［8］，可以誘導(dǎo)AS 活化釋放TNF-α 和IL-1β 等細胞因子引起炎性反應(yīng)。本實驗以體外培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)AS 為研究對象，建立LPS 誘導(dǎo)AS 損傷模型，在細胞水平上探討肌肽對LPS 誘導(dǎo)AS 炎癥損傷的影響及其作用機制，為肌肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器新生SD 大鼠由錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號： SCXK （遼） 2017-0004。DMEM-F12 培養(yǎng)液（美國Hyclone 公司），肌肽（純度＞99.0%，批號：1901036，由蘇州富士萊醫(yī)藥股份公司惠贈），神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（GA-5）（盛克魯斯生物技術(shù)有限公司），LPS、10×多聚賴氨酸、D-Hank’s 液、DAPI 染液、4%多聚甲醛固定液和Hoechst33258熒光染料（中國索萊寶公司），0.25%胰酶-EDTA（美國Gibco 公司），1%青霉素-鏈霉素雙抗、PBS緩沖液、RIPA 裂解液和活性氧檢測試劑盒（中國碧云天公司），NF-κB p65 一抗、Cy3 IgG 抗兔二抗、TNF-α 和IL-1β 酶 鏈 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司）。CS150G Ⅻ超速離心機（日本日立公司），凝膠成像儀、電泳儀和轉(zhuǎn)印機（美國Bio-Rad 公司），多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），激光共聚焦顯微鏡和熒光倒置顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和鑒定取新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，用75%酒精浸泡大鼠30 s，在超凈工作臺內(nèi)取雙側(cè)大腦皮質(zhì)。用D-Hank’s緩沖液沖洗，以去除血絲，用眼科剪將組織剪成1 mm×1 mm×1 mm 組織塊。加入0.25%胰蛋白酶溶液后置于37 ℃消化10 min，再加入與胰蛋白酶溶液等體積的含15%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液終止消化，吹打混勻。用200 目濾網(wǎng)過濾組織液去除大塊組織，1 000×g 離心5 min，棄上清液，再加入5 mL 含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)液，吹打細胞，將5 mL 細胞懸液全部轉(zhuǎn)移到25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)30 min，將含有細胞的培養(yǎng)液吸出，重新鋪入新的25 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。第2 天換1 次液，之后每3～4 d 換1 次液。培養(yǎng)10 d 細胞完全融合后，轉(zhuǎn)移至無菌恒溫搖床過夜，去除小膠質(zhì)細胞［9］，剩余的貼壁細胞用胰酶消化傳代至第3 代得到純化的AS。參照本實驗室前期建立的實驗方法［10］進行AS 純度鑒定，可以用于后續(xù)實驗。所有的培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均預(yù)先用終濃度為50 mg·L－1的多聚賴氨酸包被。

1.3 細胞分組和藥物處理取對數(shù)生長期的第3 代AS，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后按血清饑餓法換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞隨機分為對照組、LPS組、LPS+肌肽組（10、30 和90 mmol·L－1）。對照組加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；LPS 組完全培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mg·L－1的LPS，培養(yǎng)24 h［11］；LPS+肌肽組培養(yǎng)基中分別加入終濃度為10、30 和90 mmol·L－1的肌肽，培養(yǎng)1 h 后再加入LPS 使其終濃度為1 mg·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT 法檢測各組AS 存活率細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按“1.3”細胞分組和藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后加入20 μL MTT 溶液（5 g·L－1），37 ℃培養(yǎng)4 h 后，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，于振蕩器上振蕩10 min，在全自動酶標(biāo)儀490 nm 處測定吸光度（A）值，實驗重復(fù)3 次，設(shè)復(fù)孔3個，取平均值為最終結(jié)果。細胞存活率=（實驗組A 值-空白對照組A值）/（對照組A值-空白對照組A 值）×100%。

1.5 ELISA 法 檢 測AS 培 養(yǎng) 液 中IL-1β 和TNF-α水平收集各組AS 上清液，采用ELISA 法檢測IL-1β 和TNF-α 表達水平。試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定，具體操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。在450 nm 處測得A 值，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)直線回歸方程計算細胞因子水平，結(jié)果以pg·L－1表示。

1.6 DCFH-DA 熒光探針法檢測AS 中活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平ROS 是導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激的主要因素之一，可通過DCFHDA 熒光探針法檢測細胞中ROS 水平。熒光探針DCFH-DA 本身沒有熒光，細胞內(nèi)的ROS 可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF，進而通過檢測DCF 的熒光強度反映細胞中ROS 水平。具體檢測方法如下：細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，按“1.3”細胞分組和藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照1∶1 000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol·L－1。去除6孔細胞培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，采用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，每次5 min。收集細胞后用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強度。激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長530 nm。以熒光強度表示細胞中ROS水平。

1.7 Hoechst 33258 染色法檢測各組AS 凋亡率細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，按“1.3”細胞分組和藥物處理，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 緩沖液清洗2 次。采用4% 多聚甲醛4 ℃固定10 min，用PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。加入500 μL 10 mg·L－1Hoechst 33258 染 液，37 ℃避 光 染 色20 min， PBS 緩沖液清洗3 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照?？梢娂毎吮蝗境伤{色，其中活細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)固縮，細胞核內(nèi)可見濃染且致密的亮藍色熒光。顯微鏡下任意選取6 個視野計數(shù)凋亡細胞，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.8 免疫熒光細胞化學(xué)染色檢測各組AS 中p-NFκB p65 蛋白表達量和p-NF-κB p65 陽性細胞數(shù)按“1.3”細胞分組和藥物處理，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS 緩沖液緩沖液清洗3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS緩沖液清洗3次，每次5 min。加入0.2% Triton X-100 室溫透化10 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。3%羊血清室溫封閉1 h，吸掉封閉液，直接加入3%羊血清配制的p-NF-κB p65 一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜。次日將6 孔細胞培養(yǎng)板取出室溫復(fù)溫45～60 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。加入3% 羊血清配置的Cy3 IgG 抗兔二抗（1∶200），37 ℃水浴鍋避光孵育30 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min。加入2 mg·L－1DAPI 染液室溫避光染色10 min，PBS 緩沖液清洗3 次，每次5 min，免疫熒光顯微鏡下避光觀察并拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)p-NF-κB p65陽性細胞數(shù)。

1.9 Western blotting 法 檢 測 各 組AS 中NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白表達水平采用RIPA 裂解液裂解提取各組細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，加Lodding buffer 煮沸5 min，放置室溫后點樣進行SDS-PAGE 凝膠電泳，先用90 V 電壓進行電泳約20 min，后將電壓調(diào)至120 V，待指示劑降至凝膠底端時停止電泳，轉(zhuǎn)膜。5% BSA 封閉液搖床封閉2 h ，放在搖床上用TBST 洗3 次，每次5 min，滴加一抗4 ℃過夜。次日采用TBST在搖床上洗3次，每次10 min，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育2 h。再用TBST洗3次，每次10 min，配制ECL 顯影液于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，采用Image Lab 6.0 軟件對各組結(jié)果進行灰度分析，計算p-NF-κB p65 與NF-κB p65 灰度值的比值，以該比值表示p-NF-κB p65 蛋白表達水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細胞存活率、AS 培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α 表 達 水 平、AS 中ROS 水 平、AS 凋 亡 率、p-NF-κB p65 陽性細 胞數(shù)、AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以-±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組AS存活率MTT檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，LPS 組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+肌肽組（10、30和90 mmol·L－1肌肽）細胞存活率升高（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組AS 培養(yǎng)液中IL-1β 和TNF-α 水平與對照 組 比 較，LPS 組AS 培 養(yǎng) 液 中IL-1β 和TNF-α 表達水平明顯升高（P＜0.05）。與LPS 組比較，LPS+肌肽組（10、30 和90 mmol·L－1肌肽） AS培養(yǎng)液中IL-1β 和TNF-α 表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表1。

圖1 MTT 法檢測各組AS 存活率Fig. 1 Survival rates of AS in various groups detected by MTT assay

表1 各組AS 培養(yǎng)液中IL-1β 和TNF-α 水平Tab. 1 Levels of IL-1β and TNF-α in AS culture medium in various groups [n=3,-±s,ρB/(pg·L－1)]

表1 各組AS 培養(yǎng)液中IL-1β 和TNF-α 水平Tab. 1 Levels of IL-1β and TNF-α in AS culture medium in various groups [n=3,-±s,ρB/(pg·L－1)]

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with LPS group.“－”：No data.

Dose[cB/(mmol·L－1)]IL-1β 44.5±3.9 159.2±13.5*110.0±12.3△68.9±8.6 △47.7±8.8 △Group Control LPS LPS+carnosine－－1 0 30 90 TNF-α 49.8±9.4 172.7±7.3*129.3±7.9 △89.1±7.3 △57.3±5.6 △

圖2 DCFH-DA熒光探針法檢測各組AS中ROS水平Fig. 2 ROS levels in AS in various groups detected by DCFH-DA fluorescent probe

2.3 各組AS 中ROS 水平與對照組比較，LPS 組AS 中ROS 水平升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+肌 肽 組（10、30 和90 mmol·L－1肌肽）AS 中ROS 水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

2.4 各組細胞凋亡形態(tài)表現(xiàn)熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示：對照組細胞核呈彌散均勻的藍色熒光。而凋亡的AS 核染色質(zhì)固縮，呈濃密的亮藍色熒光。與對照組比較，LPS 組AS 細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+肌肽組（10、30 和90 mmol·L－1） AS 細 胞 凋 亡 率 降 低（P＜0.05）。見圖3 和4。

圖3 Hoechst 33258 染色法檢測各組AS 凋亡形態(tài)表現(xiàn)Fig.3 Morphology of apoptosis of AS in various groups detected by Hoechst 33258 staining

2.5 各組AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達量和p-NFκB p65 陽性細胞數(shù)與對照組比較，LPS 組AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達量升高；與LPS 組比較，LPS+肌肽 組（10、30 和90 mmol·L－1） AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達量減少。與對照組比較，LPS 組p-NF-κB p65陽性細胞數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+肌肽組（10、30 和90 mmol·L－1） AS 中p-NF-κB p65 陽 性 細 胞數(shù)明顯降低P＜0.05）。見圖5 和6。

圖4 Hoechst 33258 染色法檢測各組AS 凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of AS in various groups detected by Hoechst 33258 staining

2.6 各組AS 中NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白 表達水平Western blotting 法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，LPS 組AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+肌肽 組（10、30 和90 mmol·L－1肌肽）AS 中p-NF-κB p65 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05），以LPS+90 mmol·L－1肌肽組最明顯。見圖7。

3 討 論

圖5 免疫熒光細胞化學(xué)染色檢測各組AS 中p-NF-κB p65 表達情況(Bar=50 μm)Fig.5 Expressions of p-NF-κB p65 in AS in various groups determined by immunofluorescence cytochemical staining(Bar=50 μm)

圖6 免疫熒光細胞化學(xué)染色檢測各組p-NF-κB p65陽性細胞數(shù)Fig. 6 Number of p-NF-κB p65 positive cells in various groups determined by immunofluorescence cytochemical staining

圖7 Western blotting 法檢測各組AS 中p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 7 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of p-NF-κB p65 protein in AS in various groups detected by Western blotting method

AS 是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多、分布最廣的膠質(zhì)細胞，也是介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的細胞［12］，可抑制細胞毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥［13］。LPS 是構(gòu)成革蘭陰性菌細胞壁的活性成分之一［14］，在體外研究中LPS 刺激誘導(dǎo)AS 活化是模擬神經(jīng)系統(tǒng)損傷后AS 活化誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的常用模型［15］。因此本研究采用1 mg·L－1LPS 刺激AS，進一步探討肌肽對LPS 誘導(dǎo)的AS 炎癥因子釋放的影響。本研究結(jié)果顯 示：LPS 刺激后AS釋放的IL-1β 和TNF-α水平明顯升高，提示LPS 可使AS 炎癥因子釋放增加，說明成功構(gòu)建了AS 損傷模型。該結(jié)果與文獻［16］報道結(jié)果一致。采用肌肽預(yù)處理AS 后再加入LPS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-1β 和TNF-α 水平較LPS 組明顯降低，說明肌肽可以有效抑制LPS 誘導(dǎo)AS 炎癥因子的釋放。

氧化應(yīng)激是活化AS 導(dǎo)致神經(jīng)炎癥發(fā)生的主要原因之一，嚴(yán)重的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞損傷導(dǎo)致細胞凋亡和（或）壞死［17］，其最直觀的變化就是細胞中ROS 的過度積累［9］。當(dāng)AS 受到外界因素刺激時，細胞中ROS 會觸發(fā)一系列信號通路，激活NF-κB p65，從而促進炎癥因子的分泌，加重神經(jīng)炎癥。本研究結(jié)果顯示：AS 在受LPS 刺激后，細胞中ROS 生成明顯增加。與LPS 組比較，肌肽預(yù)處理AS 可以明顯降低LPS 引起細胞中ROS 水平升高。本研究結(jié)果表明：LPS 可以誘導(dǎo)AS 中ROS 水平升高，而肌肽對其具有抑制作用。

NF-κB 是由p50 和p65 組成的異源二聚體，是一組與結(jié)構(gòu)相關(guān)的真核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控多種細胞過程，包括免疫應(yīng)答、炎癥、凋亡和生長發(fā)育［18］。作為普遍存在于細胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB 在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵性作用［19］，其主要亞基是NF-κB p65。在正常情況下，NF-κB p65 與NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復(fù)合體分布于細胞漿；當(dāng)受到刺激后，NF-κB p65 被激活從胞漿轉(zhuǎn)移入核［20］，促下游炎癥因子釋放。NF-κB p65 的磷酸化激活是調(diào)控細胞炎癥的關(guān)鍵［21］。本研究結(jié)果顯示：LPS 刺激AS 并使細胞核內(nèi)的p-NF-κB p65 蛋白表達水平明顯升高，提示NF-κB p65 被激活，進而激活了炎癥途徑；而肌肽預(yù)處理AS 后，AS細胞核中p-NF-κB p65 蛋白表達水平降低，因而推測，肌肽可能通過抑制NF-κB p65 蛋白活化引起的炎癥因子表達，從而抑制LPS 誘導(dǎo)的AS 炎癥損傷。

綜上所述，肌肽可以通過抑制LPS 誘導(dǎo)AS 中IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放來發(fā)揮抗炎作用，其機制是肌肽通過清除活化的AS 中ROS 的生成抑制氧化應(yīng)激，進而抑制NF-κB p65 激活來發(fā)揮作用。本研究初步揭示了肌肽對LPS 誘導(dǎo)的AS 炎癥損傷的作用，為肌肽在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的應(yīng)用提供了初步的理論依據(jù)。