祁冰雪, 馬 彥, 張藝獻(xiàn), 孫亞東, 苗里寧

（1. 吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春130021；2. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 長春 130041）

糖尿病腎病是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的最主要原因之一。足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病出現(xiàn)蛋白尿的重要原因，因此保護(hù)腎小球足細(xì)胞是降低尿蛋白的關(guān)鍵。胰高血糖素樣肽1 （glucagon like peptide-1，GLP-1）受體激動劑模擬內(nèi)源性的GLP-1，通過激動GLP-1 受體，不僅可降低血糖，而且有延緩胃排空、抑制食欲而減少攝食、顯著減輕體質(zhì)量和保護(hù)胰島β 細(xì)胞等多重作用。近年來研究［1-4］證實：GLP-1 受體激動劑利拉魯肽能降低尿白蛋白肌酐比（urinary albumin creatinine ratio，UACR），減少新發(fā)的持續(xù)大量蛋白尿的發(fā)生，延緩糖尿病腎病進(jìn)展。研究［5-7］顯示：利拉魯肽通過抑制高級氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidative protein products，AOPP）、激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）和激活蛋白激酶B （protein kinase B，Akt）/叉頭框蛋白O1 （fork head box O1，F(xiàn)oxO1）信號通路起到保護(hù)腎臟的作用，但其機(jī)制是否通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 -kinase，PI3K）/Akt 信號通路的激活而起作用，目前尚不清楚。本文作者采用高糖誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞損傷，觀察利拉魯肽對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后足細(xì)胞相關(guān)蛋白及PI3K/Akt 信號通路蛋白表達(dá)的影響，探討利拉魯肽保護(hù)腎臟的作用機(jī)制，為利拉魯肽干預(yù)糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器小鼠永生性足細(xì)胞系由南方醫(yī)科大學(xué)史偉教授惠贈。胎牛血清（美國Gibco 公司），RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液和Ⅰ型鼠尾膠原（美國Corning 公司），DMEM 低糖培養(yǎng)基、胰酶、TRIzol、流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和熒光染料試劑盒（美國Life 公司），干擾素γ（interferon γ，IFN-γ） （以色列ProSpec 公司），乙酸（北京化工廠），Real-time PCR （RT-PCR） -反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日 本TaKaRa 公 司）， Nephrin、 Synaotopodin、Podocin、ZO-1、Bcl-2 和caspase-3 抗體試劑盒（美國Abcam 公司）。PI3K 和Akt 抗體試劑盒（美國Cell Signaling Technology 公司），LY294002（美國Sigma 公司），利拉魯肽（丹麥諾和諾德公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），熒光倒置顯微鏡（美國Gibco 公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman 公司），激光掃描共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），PCR 儀（美國Life 公司），紫外線分光光度儀（美國Thermo 公司），低溫離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）， CX23 顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)采用RPMI-1640 培養(yǎng)基（含20 U·mL－1INF-γ）培養(yǎng)增殖期足細(xì)胞，在33 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞增殖和傳代。在37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，用鼠尾膠原包被培養(yǎng)皿，加入不含有INF-γ 的低糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)分化期足細(xì)胞，誘導(dǎo)分化10～14 d。增殖期與分化期足細(xì)胞每3～4 d 傳代1 次，傳代比例為1∶4。

1.3 細(xì)胞分組和處理根據(jù)研究內(nèi)容不同，將培養(yǎng)分化成熟的足細(xì)胞給予不同的隨機(jī)分組。①利拉魯肽對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后相關(guān)蛋白mRNA 及蛋白表達(dá)影響的分組情況：對照組（5.5 mmol·L－1葡萄糖）、甘露醇對照組（5.5 mmol·L－1葡萄糖+24.5 mmol·L－1甘露醇）、高糖組（30 mmol·L－1葡萄糖） 和利拉魯肽組（5.5 mmol·L－1葡萄糖+50 nmol·L－1利拉魯肽）和高糖+利拉魯肽組（30 mmol·L－1葡萄糖+50 nmol·L－1利拉魯肽）。②利拉魯肽對PI3K/Akt 信號通路蛋白表達(dá)影響的分組情況：對照組（5.5 mmol·L－1葡萄糖）、高糖組（30 mmol·L－1葡萄糖）、高糖+利拉魯肽組（30 mmol·L－1葡萄糖+50 nmol·L－1利拉魯肽）、高糖+利 拉 魯 肽+LY294002 組（30 mmol·L－1葡萄糖+50 nmol·L－1利拉魯肽， LY294002 預(yù) 處 理1 h）。各組細(xì)胞同步培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。

1.4 RT-PCR 法檢測足細(xì)胞中各標(biāo)志蛋白mRNA表達(dá)水平TRIzol 法提取足細(xì)胞RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。構(gòu)建10 μL、1 000 ng 總RNA 反應(yīng)體系（冰上操作）。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、30 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、85 ℃、5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），-20 ℃保存。PT-PCR 反應(yīng)采用Life SYBR 試劑盒，引物設(shè)計及合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。各標(biāo)志蛋白引物名稱及序列分別為：Nephrin Forward 5'-TTTGCTGTCTTGCTGGTCTG-3'，Reverse 5'-GGGATGGAAATCTGGCTGTA-3'；Podcin Forward 5'-GCCTTTTCTCCCACCCTATC-3'， Reverse 5'-CAGGAAGCAGATGTCCCAGT-3'； ZO-1 Forward 5'-ATTTCACGGAGGGAACTGTG-3'， Reverse 5'-AAGGGGAGCCTGTTAGGGTA-3'。

構(gòu)建含20 ng 總RNA 的25 μL PCR 反應(yīng)體系，采用兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。本研究結(jié)果采用相對定量數(shù)據(jù)分析法中的雙標(biāo)曲線法表示足細(xì)胞中Nephrin、Podocin 和ZO-1 mRNA 相對表達(dá)水平。計算公式：目的蛋白mRNA 表達(dá)水平=（實驗組目的蛋白mRNA 表達(dá)水平）/（實驗組內(nèi)參mRNA表達(dá)水平）/（對照組目的蛋白mRNA 表達(dá)水平/對照組內(nèi)參基因表達(dá)水平）。

1.5 Western blotting 法檢測足細(xì)胞中各標(biāo)志蛋白及PI3K/Akt 信號通路蛋白表達(dá)水平整個操作在冰上進(jìn)行。采用提前配置好的細(xì)胞裂解液（1 mL 1×RIPA+10 μL PMSF+10 μL 磷 酸 酶 抑 制 劑）裂解細(xì)胞后進(jìn)行總蛋白的提取，BCA 法檢測蛋白濃度；20 μg 蛋白溶液加入RIPA 調(diào)定成相同體積25 μL，加入5×Loading buffer，加入量為（樣本蛋白+RIPA 量）/4；進(jìn)行蛋白變性；當(dāng)日變性后加樣，配置凝膠后，每孔等體積上樣（上樣量為20 μg），電泳，轉(zhuǎn)膜后麗春紅S 染色5 min，然后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，一抗孵育，4 ℃搖床震蕩過夜。根據(jù)一抗種屬選擇二抗，室溫震蕩孵育1 h。洗滌后加入HRP-ECL 化學(xué)發(fā)光，經(jīng)顯影、定影、水洗和晾干后使用Image J 5.2 軟件分析圖像，計算目的蛋白相對表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.6 免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin 的表達(dá)情況制作6 孔板細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行干預(yù)處理（高糖及利拉魯肽刺激）24 h，然后每孔加入4%多聚甲醛500 μL 進(jìn)行細(xì)胞固定，再進(jìn)行細(xì)胞透化、封閉，加入一抗過夜，加入1∶400 稀釋的CY3 兔二抗，室溫下孵育1 h。滴含DAPI 的封片劑封片后，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取多個視野進(jìn)行觀察并照相。形態(tài)學(xué)上主要觀察足細(xì)胞特異性骨架蛋白絲狀結(jié)構(gòu)是否被破壞，同時應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件對足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin 相對表達(dá)量的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測足細(xì)胞凋亡率干預(yù)處理后，將足細(xì)胞胰酶消化，離心，加入用100 μL ⅨAnnexin-Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Alexa Fluor 488 和1 μL 100 mg·L－1PI Working solution 輕輕混勻后于室溫避光條件下孵育15 min；加 入400 μL ⅨAnnexin-Binding Buffer 懸 浮 細(xì) 胞，輕柔混勻，將樣品置于冰上；在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組足細(xì)胞中Nephrin、Podocin 和ZO-1 mRNA 表達(dá)水平及Nephrin、Podocin、ZO-1、caspase-3、 Bcl-2、 PI3K和磷 酸 化 Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）蛋白表達(dá)水平，足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin 熒光強(qiáng)度及足細(xì)胞凋亡率均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白mRNA 表達(dá)水平與對照組比較，甘露醇對照組和利拉魯肽組足細(xì)胞中各標(biāo)志蛋白mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），高糖組足細(xì)胞中Nephrin、Podocin 和ZO-1 mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與高糖組比較， 高糖+ 利拉魯肽組足細(xì)胞中Nephrin、Podocin 和ZO-1 mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白mRNA 表達(dá)水平Fig. 1 Expression levels of marker protein mRNA in podocytes in various groups

2.2 各組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白和凋亡基因蛋白表達(dá)水平與對照組比較，高糖組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白Nephrin、Podocin 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），凋亡基因caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），抑癌基因Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。而甘露醇對照組與利拉魯肽組則無明顯差異（P＞0.05）。與高糖組比較，高糖+利拉魯肽組足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin、Podocin 和ZO-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），凋亡基因caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），抑癌基因Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖2 和3。

2.3 各組足細(xì)胞中特異性骨架蛋白Synaptopodin的表達(dá)情況與對照組比較，高糖組足細(xì)胞中特異性骨架蛋白Synaptopodin 熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05），Synaptopodin 絲狀結(jié)構(gòu)破壞，皺縮于核周表達(dá)。與高糖組比較，高糖+利拉魯肽組足細(xì)胞中特異性骨架蛋白Synaptopodin 熒光強(qiáng)度明顯升高（P＜0.05）。而甘露醇對照組和利拉魯肽組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4和5。

圖2 各組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白和凋亡基因蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of marker proteins and apoptotic gene proteins in podocytes in various groups

圖3 各組足細(xì)胞中標(biāo)志蛋白和凋亡基因蛋白表達(dá)水平Fig. 3 Expression levels of marker proteins and apoptotic gene proteins in podocytes in various groups

圖4 免疫熒光法檢測各組足細(xì)胞中特異性骨架蛋白Synaptopodin 的表達(dá)（×400）Fig. 4 Expressions of specific skeleton protein Synaptopodin in podocytes in various groups detected by immunofluorescence method（×400）

2.4 各組足細(xì)胞凋亡率與對照組比較，高糖組足細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），而甘露醇對照組和利拉魯肽組足細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與高糖組比較，高糖+利拉魯肽組足細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。見圖6 和7。

2.5 各組足細(xì)胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2 和caspase-3蛋白表達(dá)水平與對照組比較，高糖組足細(xì)胞中PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與高糖組比較，高糖+利拉魯肽組足細(xì)胞中PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與高糖+利拉魯肽組比較，高糖+利拉魯肽+LY294002 組足細(xì)胞中PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），足細(xì)胞中caspase-3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖8 和9。

3 討 論

圖5 各組足細(xì)胞中特異性骨架蛋白Synaptopodin 的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of specific skeleton protein Synaptopodin in podocytes in various groups

糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥之一，也是全球?qū)е陆K末期腎病的主要原因，其病因尚不清，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括異常糖脂代謝、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等［8-10］。一旦發(fā)展到終末期腎病，往往治療都很棘手，因此及早防治對抑制和延緩糖尿病腎病進(jìn)展至關(guān)重要。足細(xì)胞損傷及數(shù)量的減少是糖尿病腎病大量蛋白尿生成的分子基礎(chǔ)［11］。正常足細(xì)胞受損后引起濾過屏障功能的改變，導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生［12-13］。足細(xì)胞在各種致?lián)p傷因素作用下可以發(fā)生非形態(tài)學(xué)的改變，如足細(xì)胞標(biāo)志蛋白分子表達(dá)的下調(diào)和足細(xì)胞細(xì)胞骨架成分的變化等［14］。足細(xì)胞眾多作用的維持都依賴獨(dú)特的足細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)中的頂端膜區(qū)、基底膜附著基膜區(qū)以及裂孔隔膜區(qū)蛋白（nephrin、podocin 和ZO-1 等） 與足突肌動蛋白細(xì)胞骨架蛋白（synaptopodin 等） 緊密的連接。研究［15-16］顯示：nephrin 和podocin 可作為糖尿病腎病早期診斷的特異性生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示：高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后，足細(xì)胞標(biāo)志蛋白及骨架蛋白表達(dá)下調(diào)，說明足細(xì)胞在高糖作用下發(fā)生分子結(jié)構(gòu)標(biāo)志蛋白及骨架蛋白的變化。研究［17］顯示：足細(xì)胞分子也可發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如腎小球基底膜增厚、足突融合、細(xì)胞肥大和細(xì)胞凋亡等。研究［18-19］表明：糖尿病腎病與足細(xì)胞的損傷和凋亡有關(guān)。因此保護(hù)足細(xì)胞免受損傷是減少蛋白尿及阻止慢性腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵所在，其將成為腎臟病治療的新靶點(diǎn)。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組足細(xì)胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rates of podocytes in various groups detected by flow cytometry

圖7 各組足細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of podocytes in various groups

圖8 各組足細(xì)胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 8 Electrophoregram of expressions of PI3K,Akt,Bcl-2，and caspase-3 proteins in podocytes in various groups

圖9 各組足細(xì)胞中PI3K、p-Akt、Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達(dá)水平Fig. 9 Expression levels of PI3K, p-Akt, Bcl-2 and caspase-3 proteins in podocytes in various groups

GLP-1 是一種腸促胰素，餐后由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞生成，具有葡萄糖依賴的胰島素促泌作用。GLP-1 在循環(huán)中存在時間很短，半衰期只有1～2 min，釋放入血后通過DPP4 酶、肽鏈內(nèi)切酶翻譯后分解、肽酰胺化單加氧酶C 端酰胺化［20］。目前GLP-1 受體激動劑被廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病患者的治療。研究［21］表明：GLP-1 可以保護(hù)腎臟，治療糖尿病腎病。另外，關(guān)于利拉魯肽改善糖尿病腎病作用機(jī)制的研究［22］顯示：這種保護(hù)作用不僅僅源于其獨(dú)立的降糖能力，而且與其抗炎及抗氧化應(yīng)激的作用有關(guān)；GLP-1 與受體結(jié)合后，活化蛋白激酶A （protein kinase A， PKA）和環(huán) 磷 酸 腺 苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP） 從而抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶。GLP-1 抑制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），但增加了PKA，從而減少氧化應(yīng)激。LILJEDAHL等［23］發(fā)現(xiàn)：利拉魯肽可增加鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)糖尿病腎病小鼠腎臟結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，同時也增加了參與氧化應(yīng)激的蛋白表達(dá)。此外，GLP-1 已被證明具有抑制腎纖維化及對尿鈉排泄的感應(yīng)作用［24-26］。本研究結(jié)果顯示：高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，引起足細(xì)胞標(biāo)志蛋白mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)，凋亡基因表達(dá)上調(diào)，抑癌基因表達(dá)下調(diào)，而利拉魯肽組可逆轉(zhuǎn)上述變化，利拉魯肽可改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，有保護(hù)足細(xì)胞作用，與LILJEDAHL 等［23］研究結(jié)果一致。

目前已有文獻(xiàn)［5-7］報道利拉魯肽改善糖尿病腎病的作用機(jī)制：利拉魯肽通過抑制AOPP、激活Sirt1 和激活A(yù)kt/FoxO1 信號通路起到保護(hù)腎臟的作用。REN 等［27］研究顯示：嘌呤霉素抑制了CD2相關(guān)蛋白（CD2AP）mRNA 的表達(dá)，CD2AP 蛋白表達(dá)下降，引起SD 分子結(jié)構(gòu)區(qū)域紊亂，使SD 分子結(jié)構(gòu)功能受損，使CD2AP 與p85 功能區(qū)域不能正常結(jié)合，從而影響PI3K/Akt 信號通路的激活，使糖原合成酶激酶3β （glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β） 磷酸化被抑制，引起足細(xì)胞凋亡，與本實驗足細(xì)胞中觀察到的通路蛋白變化情況一致。PI3K/Akt 信號通路在足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。小檗堿通過TGFβ1 介導(dǎo)激活PI3K/Akt 信號通路減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及凋亡，從而保護(hù)腎臟［28-30］，在本研究中，利拉魯肽可通過激活PI3K/Akt 信號通路抑制足細(xì)胞凋亡。PI3K 抑制劑LY294002 可抑制PI3K/Akt 信號通路，從而抑制利拉魯肽對腎臟的保護(hù)作用，引起足細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的增加。利拉魯肽對PI3K/Akt 信號通路激活起到的足細(xì)胞保護(hù)作用是否通過其他蛋白介導(dǎo)，需要進(jìn)一步實驗研究加以證實。

綜上所述，高糖使足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin、Podocin 和ZO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)降低，Bcl-2 表達(dá)降低，caspase-3 表達(dá)升高。利拉魯肽可使足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)上調(diào)，足細(xì)胞特異性骨架蛋白Synaptopodin 免疫熒光強(qiáng)度增加，減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，足細(xì)胞凋亡減少；利拉魯肽對足細(xì)胞發(fā)揮的保護(hù)作用機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt 信號通路而實現(xiàn)的。