蔡驍垚，林堃銀，孫 濤，張 立，閆佩毅，金 姝，

1.同濟(jì)大學(xué)附屬普陀人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海200060；2.同濟(jì)大學(xué)附屬普陀人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200060

金黃色葡萄球菌是一種重要的致病菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA）在金黃色葡萄球菌中的分離率已超過40%［1-2］，無菌體液中MRSA培養(yǎng)陽性可以作為MRSA感染的診斷依據(jù)。痰標(biāo)本作為非侵入性標(biāo)本，其檢測對病原學(xué)診斷有重要參考意義［3］。因此，痰標(biāo)本MRSA培養(yǎng)陽性對感染診斷也有重要的參考意義［4］。痰液培養(yǎng)的周期為48～72 h；即便是質(zhì)譜技術(shù)，也需要培養(yǎng)出菌落才能進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，需時(shí)約24 h。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲知是否有MRSA基因的存在，其檢測結(jié)果早于細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果；但是，臨床對于痰標(biāo)本MRSA 的PCR 檢測結(jié)果的指導(dǎo)意義尚不清楚［5］。本研究中，我們定量檢測痰標(biāo)本中MRSA 的耐藥基因mecA、金黃色葡萄球菌種基因Sa442，同時(shí)進(jìn)行痰標(biāo)本的培養(yǎng)，分析定量PCR（quantitative PCR，qPCR）檢測結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的關(guān)聯(lián)；并通過對耐藥基因的定量檢測預(yù)判細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，便于更早期地指導(dǎo)臨床診療工作。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及引物

收集2017 年5 月—2018 年5 月同濟(jì)大學(xué)附屬普陀人民醫(yī)院入院送檢的痰標(biāo)本，共篩選出1 775 例合格痰標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33591，購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），為MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株，常用于抗菌藥物研發(fā)；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）購于天根生化科技（北京）有限公司；UNG 酶和Premix Ex TaqTM（2×）購自瑞士羅氏公司；引物和探針均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 痰細(xì)菌培養(yǎng)鑒定 挑取痰標(biāo)本的膿性部分涂片，革蘭染色，顯微鏡觀察，平均每個(gè)低倍（10×）視野下鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)＜10 個(gè)、白細(xì)胞＞25 個(gè)為合格痰標(biāo)本。痰標(biāo)本中加入等體積的0.1%DTT 的磷酸緩沖液，渦旋混勻后37 ℃孵育液化30 min。涂布于血平板上，5%CO2、35 ℃過夜培養(yǎng)。平板上見菌落生長，菌落出現(xiàn)β 溶血、血漿凝固酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)均陽性，鑒定為金黃色葡萄球菌，用全VITEK2 Compact自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀（美國生物梅里埃公司）分析鑒定為MRSA。同時(shí)用頭孢西丁紙片法復(fù)核：按標(biāo)準(zhǔn)K-B（Kirby-Barer）法進(jìn)行，挑取單個(gè)菌落，調(diào)整菌懸液濁度為0.5 MCF，均勻涂布于M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板，貼上30 μg 頭孢西丁紙片，在35 ℃下培養(yǎng)16～18 h，抑菌環(huán)直徑≤21 mm判定為MRSA。

1.2.2 qPCR 檢測 qPCR 絕對定量檢測復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33591，稀釋成濃度（CFU/mL）為5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102的細(xì)菌懸液，提取基因組DNA，作為定量標(biāo)準(zhǔn)品。提取痰液樣本的DNA。本實(shí)驗(yàn)使用的引物以及探針序列如下［6］。mecA-F：5'-GGT TACGGACAAGGTGAAATACTGA-3'； mecA-R： 5'-GTG TCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTA-3'；mecA探針：5'-FAMCCAGTACAGATCCTTTCTAQMAN-MGB-3'。Sa442-F：5'-CTGTAGCTTCTTTATCCATACGTTGAA-3'；Sa442-R：5'-TTCACATCGTTGTGTTGAAAAACTT-3'；Sa442探針：5'-FAM-ATTGTACGATTCTGACGCACCATCTTTTGCTMAR A-3'。反應(yīng)體系：上下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL、探針（20 μmol/L）0.3 μL、PCR Mix（2×）10 μL、DNA模板2 μL、UNG（1 U/μL）0.5 μL、H2O 5.9 μL。反應(yīng)條件：40 ℃10 min；95 ℃10 min；95 ℃10 s，60 ℃31 s（采集熒光），72 ℃1 s，40個(gè)循環(huán)；40 ℃10 s反應(yīng)終止。以2種基因qPCR反應(yīng)中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且CT值≤35為MRSA陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。率的比較采用四格表描述，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絕對定量qPCR

標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌株菌懸液倍比稀釋濃度為（5×102～5×108）CFU/mL 時(shí)，細(xì)菌濃度與檢測的CT值有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)株細(xì)菌提取DNA 后，以細(xì)菌DNA 拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，qPCR 的CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算痰樣本中的細(xì)菌數(shù)量，從而絕對定量測定痰標(biāo)本中細(xì)菌量。

圖1 mecA（A）和Sa442(B)基因qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of qPCR of mecA（A）and Sa442(B)genes

2.2 常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和qPCR檢測

經(jīng)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)，MRSA 陽性標(biāo)本64 例，陽性率為3.61%（64/1 775）；經(jīng)qPCR 檢測，MRSA 陽性237 例，陽性率為13.35%（237/1 775）。1 775 例標(biāo)本中，3.32%（59/1 775）細(xì)菌培養(yǎng)和qPCR檢測結(jié)果均為陽性，86.37%（1 533/1 775）細(xì)菌培養(yǎng)和qPCR 檢測結(jié)果均為陰性，細(xì)菌培養(yǎng)和qPCR 結(jié)果相符者占89.69%（1 592/1 775）。以細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，qPCR 檢測的靈敏度為92.19%（59/64），特異度為89.60%（1 533/1 711），陽性預(yù)測值為24.89%（59/237），陰性預(yù)測值為99.67%（1 533/1 538），可作為排除MRSA 檢出的指標(biāo)。qPCR 檢測陽性樣本中，mecA 定量對數(shù)值分布于（5.04±1.26） ～（6.23±1.23）［對應(yīng)CT值為（25.30±3.75）～（29.17±3.77）］。

2.3 受試者操作特征曲線分析對預(yù)測MRSA 培養(yǎng)結(jié)果的提示

mecA 陰性的標(biāo)本可以排除MRSA 的存在，繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線（圖2），分析mecA 定量對數(shù)值對于細(xì)菌培養(yǎng)陽性的預(yù)測價(jià)值，可見曲線下面積為0.755，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.037（95% CI 0.682～0.827），最佳臨界值為5.59，敏感度和特異度分別為72.4%和70.2%，陽性預(yù)期值和陰性預(yù)期值分別為44.2%和88.65%。在沒有定量值的情況下，以CT值繪制ROC 曲線，曲線下面積為0.770，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.035（95% CI 0.701～0.839），最佳臨界值為27.1，敏感度和特異度分別為73.0%和74.1%，陽性預(yù)期值和陰性預(yù)期值分別為47.25%和89.66%。

2.4 不同mecA 和Sa442基因檢測結(jié)果對應(yīng)不同的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

圖2 mecA定量對數(shù)值(A)以及CT值(B)的ROC曲線Fig 2 ROC curve of mecA quantitative value(A)and CT value(B)

將1 775例標(biāo)本根據(jù)基因檢測結(jié)果分為4組：1 170例mecA-Sa442-、48 例mecA-Sa442+、320 例mecA+Sa442-、237 例mecA+Sa442+，分析每組中總的細(xì)菌培養(yǎng)陽性率、不同細(xì)菌的檢出率與菌株數(shù)。僅Sa442陽性時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果以甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillinsusceptible Staphylococcus aureus， MSSA） 為 主； 當(dāng)mecA 和Sa442 均為陽性時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)陽性率為50.63%，以MRSA為主。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1和圖3。

表1 mecA和Sa442基因檢測結(jié)果及所對應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果Tab 1 Bacterial culture results corresponding to different results of gene mecA and Sa442

圖3 不同mecA和Sa442基因檢測結(jié)果所對應(yīng)的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果Fig 3 Bacterial culture results corresponding to different mecA and Sa442 gene results

3 討論

《2018 年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告》［7］指出，臨床標(biāo)本（主要來源于痰、尿、血標(biāo)本，分別占41.5%、18.8%、9.2%）細(xì)菌檢驗(yàn)中，革蘭陽性菌分離率最高的為金黃色葡萄球菌，MRSA 檢出率為30.9%，其中上海市最高（46.8%）。金黃色葡萄球菌中檢出耐藥基因mecA 或其編碼的耐藥蛋白青霉素結(jié)合蛋白2a （penicillin binding protein 2a，PBP2a），是檢出MRSA 的金標(biāo)準(zhǔn)［8］。Sa442基因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌種基因［9］。mecA 和Sa442 基因同陽性時(shí)，可判定MRSA 檢測陽性［10］。與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)相比，MRSA 的qPCR 檢測有明顯的時(shí)間優(yōu)勢，且陽性檢出率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)［11-12］。有研究報(bào)道［13］，qPCR 和培養(yǎng)法分別檢測鼻拭子的MRSA，兩者的一致性很高，在患者應(yīng)用抗生素的情況下qPCR 法的結(jié)果更可能為陽性。本研究數(shù)據(jù)表明，在痰MRSA 的檢測中，qPCR 檢測與常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)相符率為89.69%，陰性預(yù)測值達(dá)到99.67%。qPCR 可檢測出更多的陽性標(biāo)本，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度［14-15］。

本研究采用ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)mecA定量對數(shù)值為5.59 時(shí)，MRSA 培養(yǎng)陽性率為72.4%，特異度為70.2%，ROC 曲線下面積為0.755。如果用ROC 曲線分析CT值，CT值為27.1 時(shí)，其預(yù)判MRSA 培養(yǎng)陽性的靈敏度為73.0%，特異度為74.1%，曲線下面積為0.770。一般來說曲線下面積在0.7～0.9 表示診斷價(jià)值中等，因此細(xì)菌培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中，約73%的標(biāo)本mecA 定量對數(shù)值＞5.59，或者Ct 值＜27.1。細(xì)菌培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中，70%～73%的mecA 定量對數(shù)值＜5.59，或者Ct 值＞27.1。因此，能在細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果明確之前，利用分子診斷技術(shù)早期對培養(yǎng)結(jié)果有一個(gè)預(yù)判。當(dāng)面對一份痰培養(yǎng)MRSA 陽性結(jié)果時(shí)，臨床醫(yī)師有較豐富的經(jīng)驗(yàn)將其用于診療工作中；但是，對于痰PCR 的陽性結(jié)果，由于其顯著增高的陽性率，指導(dǎo)臨床診療尚需要謹(jǐn)慎。分析痰PCR 結(jié)果的定量值與培養(yǎng)結(jié)果的關(guān)系，用于預(yù)判培養(yǎng)的結(jié)果，使得臨床醫(yī)師更容易理解PCR結(jié)果，用于指導(dǎo)臨床診療。

不同的mecA和Sa442基因檢測結(jié)果，對應(yīng)不同的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。Sa442為金黃色葡萄球菌的種的特異基因，當(dāng)痰PCR檢測結(jié)果僅出現(xiàn)Sa442基因陽性時(shí)，極少培養(yǎng)出常見的革蘭陰性桿菌（如肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌），多為MSSA 培養(yǎng)陽性。而僅mecA 基因陽性時(shí)，培養(yǎng)結(jié)果為鮑曼不動桿菌占優(yōu)勢，但尚未見鮑曼不動桿菌攜帶mecA基因的報(bào)道。僅有文獻(xiàn)［16］報(bào)道，鮑曼不動桿菌含有7種PBP，不包含mecA基因表達(dá)產(chǎn)物PBP2a。因此，出現(xiàn)單一mecA 基因陽性可能為樣本中的條件致病菌即凝固酶陰性的葡萄球菌攜帶mecA基因?qū)е?。?dāng)mecA和Sa442均為陽性時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)陽性率顯著上升，以MRSA培養(yǎng)陽性為主。當(dāng)mecA和Sa442基因均為陰性時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)陽性率僅為7.18%，以肺炎克雷伯菌培養(yǎng)陽性為主。

用qPCR 法檢測痰標(biāo)本中的MRSA 時(shí)，一份陰性的qPCR結(jié)果（mecA-Sa442-）意味著細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率較低（7.18%），且可能以肺炎克雷伯菌為主，幾乎可以排除MRSA 存在；一份單陽性PCR 結(jié)果（mecA-Sa442+、mecA+Sa442-） 說明細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率會成倍增加（14.58%和20.00%），分別以MSSA 或鮑曼不動桿菌為主；當(dāng)PCR 結(jié)果為mecA 和Sa442 均陽性時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)陽性率達(dá)50.63%，以MRSA為主。并且，當(dāng)mecA定量對數(shù)值＞5.59 或者Ct 值＜27.1 時(shí)，與MRSA 培養(yǎng)陽性有較好的一致性。

綜上，qPCR 技術(shù)顯著提高了MRSA 檢測的靈敏度，陰性和陽性結(jié)果均可以從不同角度為臨床提供可能的細(xì)菌培養(yǎng)的信息。本研究為qPCR 技術(shù)更可靠地應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。