王海紅，高 碩，朱 軍，周 雋

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院中法生命科學(xué)和基因組研究中心，上海200025

干擾素調(diào)節(jié)因子2 結(jié)合蛋白2（interferon regulatory factor 2 binding protein 2，IRF2BP2）因首先被發(fā)現(xiàn)可與干擾素調(diào)節(jié)因子2（interferon regulatory factor 2，IRF2）結(jié)合并作為其轉(zhuǎn)錄輔因子而得名［1］。在人類基因組中只有1 個IRF2BP2 基因（基因ID 359948，定位于染色體1q42.3），由于剪接方式不同其可產(chǎn)生2 種轉(zhuǎn)錄物——IRF2BP2a 和IRF2BP2b。而在斑馬魚基因組中則有2 個橫向同源基因，被分別命名為irf2bp2a（基因ID 335866，定位于13 號染色體）和irf2bp2b（基因ID 406614，定位于11 號染色體）。IRF2BP2 基因?qū)儆贗RF2BP 家族，該基因在物種進化中極為保守，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)含有1個位于N端的C4 型鋅指結(jié)構(gòu)域和1 個位于C 端的C3HC4 型環(huán)指結(jié)構(gòu)域。這種特殊的結(jié)構(gòu)特征為該蛋白家族所特有，不同于任何其他已知類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。目前已知IRF2BP2 蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域具有與家族成員形成同聚體或異聚體的能力，環(huán)指結(jié)構(gòu)域具有與其相互作用蛋白結(jié)合的能力［2］。

人類IRF2BP2 基因在多種組織中廣泛表達，在骨髓中的表達豐度最高。多項研究發(fā)現(xiàn)IRF2BP2 在多種生理或病理造血發(fā)育過程中發(fā)揮功能。IRF2BP2可抑制T細胞受體（T cell receptor，TCR）誘導(dǎo)的CD4陽性T淋巴細胞的激活與克隆增殖［3］。在對原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）患者進行全基因組外顯子測序的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了高突變性的IRF2BP2 基因［4］。近年來有報道［5-8］指出IRF2BP2 與人類血液腫瘤有重要聯(lián)系，在4 例早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）患者中檢測到IRF2BP2-維甲酸受體α（retinoic acid receptor α，RARα）這一新型融合基因。此外，Irf2bp2基因敲除小鼠由于紅系發(fā)育異常而導(dǎo)致胚胎致死［9］。除造血系統(tǒng)外，人類多組織RNA印跡法（Northern blotting）分析發(fā)現(xiàn)IRF2BP2 mRNA 在心臟和骨骼肌中也高度表達；IRF2BP2可作為一個缺血誘導(dǎo)的調(diào)控因子參與缺血狀態(tài)下心臟和骨骼肌血管的再生過程［10］。

模式生物斑馬魚在發(fā)育生物學(xué)研究中具有諸多優(yōu)勢。人類IRF2BP2 和斑馬魚Irf2bp2 蛋白在N 端和C 端有著幾乎相同的鋅指和環(huán)指結(jié)構(gòu)域［2］。進化分析進一步顯示這2個基因來自于共同的祖先［10］，使得我們利用斑馬魚作為模型探討irf2bp2 基因在發(fā)育過程中的生物學(xué)作用成為可能。我們對irf2bp2 的2 個橫向同源基因在胚胎期和幼蟲期的斑馬魚的時空表達譜進行分析，這將為研究其在發(fā)育中的生物學(xué)功能提供線索。

1 對象與方法

1.1 斑馬魚品系與基本培養(yǎng)條件

本研究使用的斑馬魚系的遺傳背景為圖賓根（Tubingen，TU），飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院魚房。飼養(yǎng)條件：溫度設(shè)定為28.5 ℃，pH 值控制在6.5～7.5，水循環(huán)系統(tǒng)的電導(dǎo)率設(shè)定為400～500 μS/cm。整個動物實驗符合動物福利原則，并獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物倫理委員會審批。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建和探針制備

用于全胚胎原位雜交（whole mount in situ hybridization，WISH）的irf2bp2a 和irf2bp2b 探針質(zhì)粒均以野生型斑馬魚胚胎［混合時相，受精后24 h（24 h post fertilization，24 hpf）、48 hpf 以及受精后3 d（3 d post fertilization，3 dpf）］ cDNA 為模板，經(jīng)PCR 反應(yīng)擴增獲得。引物序列見表1。探針質(zhì)粒首先進行酶切，回收后使用SP6 RNA 聚合酶或T7 RNA 聚合酶試劑盒（賽默飛，美國）合成反義RNA探針。

1.3 mRNA WISH檢測

使用斑馬魚irf2bp2a和irf2bp2b基因的反義RNA探針分 別 在 單 細 胞 期、6 hpf、12 hpf、24 hpf、30 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf 和5 dpf 進 行mRNA WISH 檢 測。用正義RNA 探針進行原位雜交的胚胎作為陰性對照。胚胎的體位包括側(cè)視、俯視和腹視。使用5-溴-4-氯-3-吲哚基- 磷 酸 鹽/四 唑 硝 基 藍（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/tetranitroblue， BCIP/NBT） 顯 色 試 劑 盒（AR1023，武漢博士德生物工程有限公司）染色結(jié)束后將胚胎放入甲基纖維素中，在DM4 型正置顯微鏡（萊卡，德國）下觀察并拍照。

1.4 實時定量PCR

以TRIzol 試劑（賽默飛，美國）提取斑馬魚胚胎總RNA，之后用單鏈cDNA合成反轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛，美國）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度儀測量濃度。應(yīng)用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（賽默飛，美國） 試劑盒進行實時定量PCR （real-time quantitative PCR，qPCR）。引物序列見表2。使用ABI ViiA7 儀器內(nèi)預(yù)設(shè)的程序進行PCR 反應(yīng)。待程序結(jié)束后，導(dǎo)出每組PCR 反應(yīng)的CT值，以β-actin 為內(nèi)參處理數(shù)據(jù)并繪制圖表。irf2bp2a和irf2bp2的表達水平以2-ΔCT表示。

表2 qPCR引物序列Tab 2 Primer sequences for qPCR

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 irf2bp2a在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達譜分析

WISH 檢測結(jié)果顯示irf2bp2a 基因有明顯的母源表達（圖1A）。進入原腸胚期后，在6 hpf 的胚胎中irf2bp2a 呈較弱的軀干泛表達（圖1B），而在胚胎體節(jié)初期（12 hpf）同樣呈現(xiàn)軀干泛表達（圖1C）。在咽囊期初期（24 hpf）irf2bp2a 主要在視網(wǎng)膜、晶狀體、端腦、小腦、中腦、中后腦交界、后腦以及聽囊和嗅囊中表達，并伴隨一定的肌節(jié)弱表達（圖1D）。在咽囊期的前幾個小時，胚胎繼續(xù)保持開始于15 hpf（結(jié)果未顯示）的快速伸長狀態(tài)，但隨后伸長速度突然下降，而在此過程中很多器官發(fā)育趨于完善。連續(xù)性地收集了30 hpf和36 hpf時相的胚胎，觀察irf2bp2a 的表達情況，發(fā)現(xiàn)在30 hpf 其主要表達在胚胎咽、胸鰭、后部造血島、肌節(jié)、聽囊和嗅囊中（圖1E）。在腦組織中，irf2bp2a 的最強表達出現(xiàn)在端腦、中腦和后腦；由于irf2bp2a的表達，可觀察到中腦（其后部除外）有一條顯著的水平溝將中腦頂蓋（溝的背側(cè)）和中腦被蓋（溝的腹側(cè)）分開（圖1E2）。irf2bp2a 在36 hpf的表達情況與30 hpf較相似，但其在后部造血島以及菱腦節(jié)的表達更為顯著，此時已很難觀察到其在肌節(jié)的表達（圖1F）。在24～72 hpf可以觀察到相似的irf2bp2a表達情況，但其在頭部區(qū)域的表達從特定地集中于中后腦區(qū)域轉(zhuǎn)變?yōu)檎麄€腦組織（包括菱腦節(jié)）的泛表達（圖1G）。值得注意的是，在48 hpf 的胚胎中，irf2bp2a 在肝臟區(qū)域、咽以及咽囊區(qū)域有明顯表達（圖1G2）。在72 hpf，irf2bp2a 依然在腦組織中呈現(xiàn)泛表達狀態(tài)（圖1H），同時也出現(xiàn)在嗅囊、下頜以及咽弓處（圖1H2）。到5 dpf，irf2bp2a在所有部位的表達都顯著降低，但在魚鰾和表皮處依然有較弱的表達（圖1I）。

圖1 WISH檢測斑馬魚irf2bp2a基因在胚胎中的表達Fig 1 Expression of irf2bp2a analyzed by WISH during zebrafish embryogenesis

2.2 irf2bp2b在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的表達譜分析

與irf2bp2a 不同的是，irf2bp2b 并沒有明顯的母源表達（圖2A），其在單細胞期以及6 hpf 時都顯示出較微弱的表達（圖2B），直至12 hpf 在軀干呈現(xiàn)泛表達（圖2C）。在24 hpf，irf2bp2b 在肌節(jié)、胸鰭、原肛和頭部區(qū)域表達，其中頭部區(qū)域主要集中在晶狀體、視網(wǎng)膜、端腦、中腦、后腦、中后腦交界、聽囊和嗅囊（圖2D）。在36 hpf，irf2bp2b 在肌節(jié)中的表達減少，主要集中在晶狀體、胸鰭、聽囊、嗅囊、咽囊和咽弓區(qū)域（圖2E）。從尾部橫斷切面觀察，發(fā)現(xiàn)其在表皮及斯坦尼小體處表達（圖2E3）。斯坦尼小體是一個涉及鈣離子調(diào)控的小器官，通常均勻地分布在兩側(cè)，但左右兩側(cè)不對稱的情況也時有出現(xiàn)。在48 hpf，觀察到irf2bp2b 在腦組織中的表達進一步減弱；有趣的是，其在中腦組織中出現(xiàn)了明顯的表達，而在眼、聽囊、嗅囊、咽弓、下頜以及胸鰭部位依然能觀察到irf2bp2b 的表達（圖2F）。在所有時相中，僅在48 hpf 檢測到irf2bp2b 在心臟區(qū)域表達（圖2F3，腹面觀），而irf2bp2a 在心臟部位未曾檢測到表達。到72 hpf可以觀察到irf2bp2b在所有部位的表達開始減弱，頭部區(qū)域僅中腦、咽弓、咽囊處有較弱的表達（圖2G）。5 dfp的WISH 檢測結(jié)果顯示，irf2bp2b 的表達情況與72 hpf 相似，且irf2bp2b開始在魚鰾中出現(xiàn)（圖2H）。

2.3 irf2bp2 基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中表達水平的檢測分析

在對irf2bp2的2個橫向同源基因進行WISH 分析后，利用qPCR 分析irf2bp2a 和irfbp2b 分別在單細胞期、6 hpf、12 hpf、24 hpf、30 hpf、36 hpf、48 hpf、72 hpf和5 dpf 時相的胚胎整體表達水平。在胚胎發(fā)育期各時相都檢測到了irf2bp2a 和irf2bp2b 基因的表達，但表達水平各不相同（圖3A、B）。irf2bp2a 基因在單細胞期有強烈的母源表達，而irf2bp2b 的表達水平在6 hpf 最弱，與WISH 結(jié)果相一致。從6 hpf 到5 dpf，irf2bp2a 的表達水平在24 hpf 時達到峰值，之后表達水平逐漸下降。irf2bp2b 從6 hpf 到5 dpf 的表達趨勢與irf2bp2a 相似，并且在24 hpf 達到峰值。值得注意的是，從整體的表達水平來比較，irf2bp2b 的表達水平要略高于irf2bp2a（圖3C）。

3 討論

作為一個泛表達的轉(zhuǎn)錄輔因子，IRF2BP2 可以和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并在不同的生理和病理過程中發(fā)揮功能。例如，生理狀態(tài)下IRF2BP2 基因在成人心肌和骨骼肌表達［10］，而在人類過度肥大的左心室中可發(fā)現(xiàn)IRF2BP2 蛋白表達水平明顯提高［11］；在小鼠中irf2bp2 的功能喪失性突變可以促進心臟肥厚性反應(yīng)，而IRF2BP2的過表達則顯示出強烈的保護性作用［11］。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，通過WISH實驗我們發(fā)現(xiàn)irf2bp2的2個橫向同源基因中只有irf2bp2b 在48 hpf 的胚胎心臟區(qū)域表達，而在斑馬魚軀干肌節(jié)中均檢測到了2 個同源基因的表達，但irf2bp2b 的表達要強于irf2bp2a 基因。此外，我們還發(fā)現(xiàn)只有irf2bp2a 基因在48 hpf 的胚胎肝臟區(qū)域有明顯表達。這些結(jié)果提示斑馬魚irf2bp2a 和irf2bp2b 可能在心臟和肝臟發(fā)育中具有不同功能，而在肌節(jié)發(fā)育過程中的功能相似。

另外，檢索人類蛋白質(zhì)圖譜（The Human Protein Atlas）數(shù)據(jù)庫中IRF2BP2 的表達，發(fā)現(xiàn)IRF2BP2 在多種造血細胞中表達，提示IRF2BP2 在造血發(fā)育過程中具有重要作用。有報道［12］顯示IRF2BP2可作為一個在巨噬細胞極化過程中的重要調(diào)控因子，小鼠和人類中IRF2BP2基因的缺失會降低巨噬細胞炎癥水平和動脈粥樣硬化的易感性。 常見變異性免疫缺陷（common variable immunodeficiency，CVID）是一種重要的原發(fā)性免疫缺陷疾病。IRF2BP2 的單基因缺陷是引起這種疾病的原因之一［13-14］。此外，IRF2BP2 被發(fā)現(xiàn)與原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）的發(fā)生相關(guān)［4］。還有報道［9］提示IRF2BP2 和輔因子核心結(jié)合因子α2（core binding factor α2，ETO2）相互作用并參與紅細胞終末分化，并且IRF2BP2 缺失小鼠會因紅系發(fā)育異常而導(dǎo)致胚胎死亡。在我們的研究中，WISH 檢測結(jié)果顯示斑馬魚irf2bp2a 在后部造血島表達；而后部造血島是在30 hpf 時相的一個造血區(qū)域，提示irf2bp2a可能在造血發(fā)育過程中發(fā)揮功能。

在小鼠小膠質(zhì)細胞中Irf2bp2 的缺失不僅會影響抗焦慮藥對新生小鼠的治療效果［15］，而且會加重局灶性缺血性腦損傷后的炎癥反應(yīng)和功能性缺失［16］。另外有研究［17］發(fā)現(xiàn)，小鼠Irf2bp2 的缺失會導(dǎo)致高脂肪飲食相關(guān)的腦損傷病情惡化以及肝臟血脂異常。在斑馬魚胚胎發(fā)育中irf2bp2a 和irf2bp2b 基因最顯著的表達出現(xiàn)在腦部區(qū)域，但二者的表達水平和持續(xù)時間不同。irf2bp2a 在腦組織區(qū)域中的表達水平和持續(xù)時間都要強于irf2bp2b。這些結(jié)果提示，irf2bp2 基因在腦組織發(fā)育過程中可能也有著重要作用。

本研究主要通過WISH技術(shù)對斑馬魚irf2bp2的2個橫向同源基因進行了時空表達分析，并揭示了二者在表達譜上的相似性和不同之處，這將為今后的功能研究提供一定的線索與提示。