劉 偉，朱敏聞，吳 嵐

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面頭頸腫瘤科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011；2.上海市徐匯區(qū)牙病防治所口腔外科，上海200032；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔黏膜科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海200011

口腔白斑（oral leukoplakia，OL）是口腔黏膜的潛在惡性疾病之一，是口腔鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）的主要來源［1］。調(diào)查［2-4］顯示，國(guó)內(nèi)OL患者的癌變率為4%～18%。上皮異常增生是OL 的病理特征。白斑的發(fā)生發(fā)展到癌變的進(jìn)程各階段較明確，是從上皮無異常增生、上皮單純?cè)錾⑤p度異常增生、中度異常增生、重度異常增生到癌變的過程，因此成為口腔癌發(fā)生發(fā)展的良好研究模型。目前普遍認(rèn)為口腔癌的發(fā)生是由遺傳學(xué)、生物學(xué)和物理化學(xué)等多種因素綜合作用所導(dǎo)致，這些因素造成了基因的突變或缺失、異常擴(kuò)增和表達(dá)［5-7］。為維持基因組的穩(wěn)定性，機(jī)體會(huì)自動(dòng)啟動(dòng)對(duì)DNA 損傷的多種修復(fù)途徑，統(tǒng)稱為DNA 損傷修復(fù)［5］。因此，檢測(cè)DNA 損傷修復(fù)因子的基因表達(dá)或相關(guān)生化特性，可能可以為白斑癌變的早期診斷及分級(jí)治療提供新策略。

組蛋白2A 變異體家族成員X（histone variant H2A family member X，H2AX）和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM） 是公認(rèn)的DNA 損傷修復(fù)特征性基因，兩者共同參與細(xì)胞內(nèi)對(duì)于DNA 雙鏈斷裂損傷修復(fù)的快速敏感的反應(yīng)［8］。H2AX 是DNA損傷應(yīng)答中的重要效應(yīng)分子之一，ATM能在DNA斷裂點(diǎn)附近絲氨酸殘基處磷酸化H2AX 形成磷酸化H2AX（γ-H2AX），ATM活化會(huì)進(jìn)一步激活γ-H2AX，磷酸化修飾會(huì)啟動(dòng)DNA 修復(fù)和激活檢查點(diǎn)的相關(guān)途徑，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展［9］。鑒于白斑癌變與DNA 損傷修復(fù)的研究報(bào)道較少［10-11］，本研究擬利用人轉(zhuǎn)錄組芯片研究OL患者病損發(fā)生發(fā)展中DNA 損傷修復(fù)的相關(guān)基因表達(dá)譜，隨后驗(yàn)證H2AX和ATM的表達(dá)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及樣本收集

本研究共納入17 例研究對(duì)象，其中正常口腔黏膜患者3 名、OL 患者8 名、口腔早期鱗癌（T1-2N0M0）患者6名。研究對(duì)象均來源于2014年9—12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面頭頸腫瘤科和口腔黏膜科就診患者。收集研究對(duì)象的人口學(xué)資料，包括年齡、性別、是否吸煙和是否飲酒。所有研究對(duì)象術(shù)前均未進(jìn)行化學(xué)治療（化療）、放射治療（放療）及激素等治療手段，且無自身系統(tǒng)性疾病和癌癥史。

研究對(duì)象的組織樣本為活檢或手術(shù)后標(biāo)本，放入裝有RNAlater 液的凍存管，于液氮浸沒15 min，放入-80 ℃冰箱保存。OL 的病理學(xué)診斷為上皮單純?cè)錾?、輕度異常增生、中度異常增生和重度異常增生白斑。以上診斷由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔病理科醫(yī)師根據(jù)WHO 組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［12］確認(rèn)。本研究將上皮單純?cè)錾洼p度異常增生合并為低危白斑，中度異常增生和重度異常增生合并為高危白斑。本研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞

人口腔鱗癌細(xì)胞系HN13 和OL 細(xì)胞系Leuk1 由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供。人正?？谇火つそ腔?xì)胞株HOK 購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 主要試劑及儀器

TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)），NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)），DMEM 培養(yǎng)基（D5546， Sigma-Aldrich， 美 國(guó)）， KSFM 培 養(yǎng) 基（Lot1646135，Gibco Island，美國(guó)），RPMI-1640 培養(yǎng)基（Thermo Scientific， 美 國(guó)）， 熒 光 定 量 PCR 儀（LightCycler?480 Ⅱ型，Roche，瑞士）。

1.4 研究方法

1.4.1 組織樣本的RNA 抽提 按照TRIzol 試劑常規(guī)提取OL、早期口腔鱗癌組織標(biāo)本和正?？谇火つそM織樣本的總RNA。利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定濃度及吸光度比值［D（260 nm）/D（280 nm）］，比率大于1.8為合格，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。納入本研究的組織樣本經(jīng)NanoDrop ND-2000 定量并經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測(cè)RNA 完整性， 檢 測(cè) 顯 示RNA 的 吸 光 度 比 值［D（260 nm）/D（280 nm）］比率均在1.8 以上，顯示RNA 質(zhì)量良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.4.2 轉(zhuǎn)錄組芯片研究及數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)錄組芯片研究按照Affymetrix GeneChip?Human Transcriptome Array（HTA）2.0 標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。采用Affymetrix GeneChip Command Console 軟件處理提取原始數(shù)據(jù)和Expression Console 軟件對(duì)芯片進(jìn)行g(shù)ene level 的標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化算法為Robust Multi-array Average（RMA）。后續(xù)分析基因表達(dá)使用的軟件為Genespring軟件。差異基因利用t檢驗(yàn)的P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）的對(duì)數(shù)（log2FC）的絕對(duì)值進(jìn)行篩選。篩選的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|≥2.0且P＜0.05。接著，對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，GO）富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng) HN13 使用DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，Leuk1 使用KSFM 培養(yǎng)基人角化上皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，HOK 使用含15%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)。所有細(xì)胞培養(yǎng)均置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。參照美國(guó)模式菌種積存庫(kù)（American Type Cell Culture，ATCC）提供的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)用于接種。

1.4.4 實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證基因表達(dá) 提取上述細(xì)胞總RNA， 反 轉(zhuǎn) 錄 成 互 補(bǔ)DNA （complementary DNA，cDNA）。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR （real-time quantitative PCR，qPCR） 反應(yīng)。體系：SYBR?Premix Ex Taq，10 μL；引物0.4 μL （表1）；cDNA，1 μL；ddH2O，7.8 μL。PCR 程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法測(cè)定相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 qPCR驗(yàn)證ATM和H2AX基因的引物序列Tab 1 Primer sequence for ATM and H2AX genes by qPCR

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證蛋白表達(dá) 提取上述細(xì)胞總蛋白，加入RIPA 裂解液及蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，加入loading-buffer 及二巰基乙醇；加樣品于10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣品，ATM 蛋白350 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，γ-H2AX 蛋白90V 恒壓1 h，PVDF 膜用3%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入ATM 和γ-H2AX 一抗4 ℃孵 育12 h；TBST 漂 洗3 次，10 min/次；加 入 二 抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗3 次，10 min/次；超敏型ECL發(fā)光液顯示陽(yáng)性條帶，在Typhoon 系統(tǒng)上掃描結(jié)果，Image J 軟件分析灰度值，以β-tubulin 為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用GraphPad 6.0 作圖。定量資料用±s 表示，正常黏膜、白斑和鱗癌3組間基因定量表達(dá)均數(shù)差別采用方差分析比較。定性資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象人口學(xué)資料比較

正常黏膜、白斑和早期鱗癌3組患者的年齡、性別等人口學(xué)資料間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 3組研究對(duì)象人口學(xué)資料比較Tab 2 Comparison of demographic data between the three groups

2.2 白斑發(fā)生發(fā)展中的DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)譜

本研究將OL 發(fā)生發(fā)展的節(jié)點(diǎn)分為低危白斑、高危白斑和早期鱗癌。經(jīng)Affymetrix HTA 2.0 轉(zhuǎn)錄組芯片檢測(cè)，低危白斑與正常黏膜之間有855個(gè)|log2FC|≥2.0的基因，高危白斑與低危白斑有399個(gè)|log2FC|≥2.0的基因，早期鱗癌與高危白斑有797 個(gè)|log2FC|≥2.0 的基因（均P＜0.05）。將白斑各階段的差異基因進(jìn)行GO 功能分析。按照GO 生物學(xué)作用分類，篩選出生物學(xué)作用為DNA 損傷與修復(fù)相關(guān)的基因（圖1），從正常黏膜發(fā)展到低危白斑有7 個(gè)|log2FC|≥2.0 的基因，從低危白斑發(fā)展到高危白斑有7 個(gè)，從高危白斑發(fā)展到鱗癌有52個(gè)（圖2）。

2.3 DNA損傷修復(fù)關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)驗(yàn)證

本研究驗(yàn)證芯片中從正常黏膜到低危白斑的H2AX基因和從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的ATM 基因，選擇人正常黏膜HOK、白斑Leuk1 和鱗癌HN13 細(xì)胞系對(duì)ATM 和H2AX行qPCR的驗(yàn)證表達(dá)研究。結(jié)果（圖3）顯示β-actin在3 組細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)分析顯示ATM 和H2AX 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量在3 組有顯著差異，且均呈階梯式升高。

2.4 DNA損傷修復(fù)蛋白ATM和γ-H2AX表達(dá)驗(yàn)證

通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)ATM 和γ-H2AX 在HOK 細(xì)胞、Leuk1 細(xì)胞和HN13 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果（圖4）顯示：內(nèi)參蛋白β-tubulin 在3 組細(xì)胞系中的表達(dá)量一致；相對(duì)于HOK 細(xì)胞，ATM 蛋白在Leuk1 細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，而在HN13 細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低，且是3 種細(xì)胞中表達(dá)最弱的；γ-H2AX 蛋白在Leuk1 細(xì)胞中的表達(dá)量略增加，在HN13 細(xì)胞中的表達(dá)量明顯上調(diào)。

圖1 從白斑發(fā)生發(fā)展各階段的全部基因中篩選出DNA損傷修復(fù)基因Fig 1 DNA damage repair genes were screened from all genes in the development and progression of leukoplakia

圖2 口腔早期鱗癌與高危白斑之間的52個(gè)差異基因聚類熱圖Fig 2 Clustering heat map of 52 different genes between oral early squamous cell carcinoma and high-risk leukoplakia

圖3 qPCR驗(yàn)證ATM和H2AX在人正常黏膜、白斑和鱗癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)Fig 3 qPCR confirmed the differential expression of ATM and H2AX in normal mucosa,leukoplakia and squamous cell carcinoma cell lines

圖4 Western blotting檢測(cè)ATM和γ-H2AX在HOK細(xì)胞、Leuk1細(xì)胞和HN13細(xì)胞中的表達(dá)Fig 4 Western blotting examined the protein expression of ATM and H2AX in HOK cells,Leuk1 cells and NH13 cells

3 討論

口腔黏膜白斑癌變的進(jìn)程是由多個(gè)異?；騾⑴c的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能改變的多步驟過程，高危白斑及其癌變的早期診斷及干預(yù)對(duì)改善預(yù)后尤為重要［12］。以往對(duì)白斑的芯片研究，僅僅設(shè)置了2 組對(duì)照研究，如王娟等［13］對(duì)口腔正常黏膜（n=3） 和白斑（n=3） 進(jìn)行的Affymetrix U133 plus 2.0 基因芯片研究，張德保等［14］對(duì)正常黏膜（n=10）和白斑（n=10）進(jìn)行的Agilent 基因組學(xué)芯片，陳顯久等［15］對(duì)白斑（n=3）和鱗癌（n=3）進(jìn)行的SupperArray 基因芯片研究。 而本研究選取的Affymetrix HTA 2.0 芯片包括近700 萬條探針，可檢測(cè)超過28 萬條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。納入轉(zhuǎn)錄組芯片的階梯式病例設(shè)置是本研究的特色。針對(duì)白斑的發(fā)生發(fā)展，本研究共設(shè)置4組病例模擬白斑癌變的多步驟進(jìn)程，包括正常黏膜組（n=3）、低危白斑組（n=4）、高危白斑組（n=4）和早期鱗癌組（n=6），研究結(jié)果可反映白斑癌變不同階段的基因組學(xué)特性。

DNA 損傷修復(fù)功能的異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，其中DNA 雙鏈斷裂伴隨細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活在其中發(fā)揮重要作用［16］。本研究中轉(zhuǎn)錄組芯片篩選出白斑發(fā)生發(fā)展各階段的DNA 損傷修復(fù)相關(guān)基因，從正常黏膜到低危白斑的常見異?；蛴蠧D44、鼠雙微體基因2（murine double minute 2，MDM2）和γ-H2AX 等，從高危白斑發(fā)展到早期鱗癌的常見異?；蛴须滋斓鞍酌?（cysteine aspartic acid specific protease，CASP3）、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（check point kinase 1，CHK1）、周期蛋白 依 賴 性 激 酶2 （cyclin dependent kinase，CDK2） 和ATM 等。本研究顯示，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3 相關(guān)蛋白（ataxia-telangiectasia mutated and Rad 3 related protein，ATR）在高危白斑發(fā)展到鱗癌有差異表達(dá)，但并未檢測(cè)發(fā)現(xiàn)明確的CHK2 和ATR2 差異表達(dá)，這提示參與DNA 單鏈斷裂的損傷修復(fù)基因有待于進(jìn)一步研究。段寧等［17］對(duì)白斑（n=4）和鱗癌（n=4）進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性芯片研究，異?；蛑饕挥诘?、5～9、11、13～15、17、18 染色體，本研究篩選出的DNA 損傷修復(fù)基因位點(diǎn)亦多位于這些染色體。

本研究結(jié)果顯示，H2AX的mRNA 和蛋白表達(dá)水平在HOK 細(xì)胞、Leuk1細(xì)胞和NH13細(xì)胞中逐步上調(diào)，并存在組間顯著差異，與芯片篩查結(jié)果基本相符。該結(jié)果提示正常上皮細(xì)胞處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，H2AX 基因的表達(dá)水平很低，但當(dāng)DNA 損傷雙鏈斷裂形成后，其mRNA 表達(dá)量會(huì)迅速上升，并磷酸化形成γ-H2AX，在轉(zhuǎn)錄后的蛋白水平表達(dá)增強(qiáng)。因此，H2AX 及其磷酸化應(yīng)該是識(shí)別白斑發(fā)生發(fā)展中DNA損傷的早期事件之一［18］。

本研究對(duì)ATM 的qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATM 的mRNA 在HOK 細(xì) 胞、Leuk1 細(xì) 胞 和NH13 細(xì) 胞 中 逐 步 上調(diào)，并存在組間顯著差異，與芯片篩查結(jié)果基本相符。Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATM 蛋白相對(duì)于HOK 細(xì)胞在Leuk1 細(xì)胞中表達(dá)升高，但在NH13 細(xì)胞中明顯降低；該結(jié)果提示ATM 蛋白的過表達(dá)是出現(xiàn)在癌變之前的白斑階段，但在癌變之后的鱗癌中其表達(dá)降低，這與ATM 在眼咽型肌營(yíng)養(yǎng)不良（oculopharyngeal muscular dystrophy，OPMD）和鱗癌中免疫表達(dá)結(jié)果相符［19］。一般認(rèn)為，一個(gè)有效的DNA 損傷修復(fù)機(jī)制能確保修復(fù)順利及時(shí)完成，維持基因組穩(wěn)定性，它是癌癥發(fā)生的保護(hù)屏障［10］。但在癌癥發(fā)生時(shí)，如果ATM 無法完全修復(fù)DNA損傷，則會(huì)造成損傷的DNA 雙鏈積聚，則最終將促進(jìn)癌癥的發(fā)生。ATM 在白斑癌變進(jìn)程中基因表達(dá)上調(diào)和蛋白表達(dá)下降結(jié)果不一致的原因可能是，DNA 損傷程度超出了ATM 的修復(fù)能力范圍或受到其他非編碼RNA 調(diào)控以致ATM 蛋白失活，導(dǎo)致DNA 損傷積累增加細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度；這與Tu 等［19］利用免疫組織化學(xué)研究ATM 在口腔癌前病損和鱗癌組織中的表達(dá)研究結(jié)果相一致。因此，ATM蛋白失活可能是白斑癌變的早期事件之一。

目前，DNA 損傷修復(fù)基因在口腔癌變進(jìn)程中的分子機(jī)制研究很少［20］。本研究結(jié)果提示，ATM 和H2AX 等基因的異常改變?cè)诎装甙l(fā)生發(fā)展中具有重要作用，白斑癌變微環(huán)境中ATM 和H2AX 等的信號(hào)通路和分子機(jī)制值得進(jìn)一步研究。綜上，本文通過研究DNA 損傷修復(fù)的基因表達(dá)譜，為深入研究OL 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、篩查標(biāo)志性癌變基因、尋找OL早期診斷的分子標(biāo)記提供了參考。