姚佳麗，徐海能，范齊昀，董昭駿，吳建章

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)研究中心，浙江 溫州 325035

胃癌的發(fā)生與食用熏烤、鹽腌食品等飲食習(xí)慣密切相關(guān)，因此其在我國(guó)等東亞人群中發(fā)病率極高，其中我國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)約占全球50%[1]。近年來(lái)由于胃鏡等檢測(cè)手段的普及，胃癌的早期診斷率在日本、韓國(guó)已分別高達(dá)60%、70%。而我國(guó)的早期胃癌診斷率仍然較低（＜10%），70%胃癌患者為進(jìn)展期或晚期，化療是進(jìn)展期或晚期胃癌除外科手術(shù)以外的必備治療手段[1-2]。但目前被批準(zhǔn)用于胃癌臨床治療的靶向藥物僅針對(duì)HER2和VEGFR靶點(diǎn)，氟尿嘧啶等傳統(tǒng)細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物仍然是一線化療用藥，而該類(lèi)藥物具有非常大的不良反應(yīng)[1，3]。

五味子丙素為木質(zhì)素的一種，也是中藥五味子中主要的活性成分之一，具有保肝[4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7]等藥理學(xué)活性。近年來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素類(lèi)化合物也具有較好的抗腫瘤活性，但是目前有關(guān)五味子丙素抗腫瘤活性的報(bào)道極少。本研究分析了五味子丙素的體外抗胃癌活性及其對(duì)臨床化療藥物的體外增敏活性，為五味子丙素在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞AGS（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），五味子丙素（成都普思生物科技有限公司），MTT粉末（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），凋亡試劑盒（美國(guó)BD Biosciences Clontech公司），Cleaved-PARP抗體、Bax抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），Bcl-2抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），GAPDH抗體（杭州賢至生物科技有限公司），結(jié)晶紫染色液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：AGS細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：將AGS細(xì)胞消化鋪板，待細(xì)胞貼壁后，加藥。藥物孵育72 h后加入MTT溶液，4 h后吸去培養(yǎng)基，加入DMSO，在微型振蕩儀上振蕩至甲臜完全溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值（OD值）。抑制率=（1-藥物組吸光度的平均值/DMSO組吸光度的平均值）×100%。在測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性的半數(shù)抑制濃度（IC50）中，藥物設(shè)置9個(gè)濃度（100、80、70、60、50、40、35、20、10 μmol/L），用Graphpad 7.0計(jì)算IC50。

1.2.3 細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)：取AGS細(xì)胞鋪入6孔板（5 000個(gè)細(xì)胞/孔）。培養(yǎng)20 h細(xì)胞貼壁后加五味子丙素，設(shè)置DMSO組、五味子丙素10 μmol/L組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素30 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組。96 h后換液（同時(shí)再加五味子丙素）。7 d后，棄培養(yǎng)基，常規(guī)清洗后4%多聚甲醛固定。常規(guī)清洗后加結(jié)晶紫染色液。最后回收結(jié)晶紫染色液，常規(guī)清洗后晾干拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡：取AGS細(xì)胞鋪于6 孔板（20 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/孔），20 h細(xì)胞貼壁后換液加五味子丙素。分別設(shè)置DMSO組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組、五味子丙素60 μmol/L組。藥物孵育36 h后，收集全部細(xì)胞，PBS洗后，離心棄去PBS。加入稀釋后的Annexin V binding buffer，在加Annexin V/PI共染。染色結(jié)束，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)lowJo 7.6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：取AGS細(xì)胞鋪于6孔板，每孔20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。20 h細(xì)胞貼壁后加五味子丙素，藥物分組同上。藥物作用30 h后提總蛋白，制備蛋白樣品?？偟鞍壮Ｒ?guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育（一抗1:1 000稀釋，二抗1:5 000稀釋）、常規(guī)洗膜，隨后在凝膠成像系統(tǒng)下檢測(cè)目的蛋白，并用Image Lab軟件進(jìn)行處理分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件繪圖，SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五味子丙素抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng) 五味子丙素具有較好的體外抗胃癌活性，其IC50為（35.73±5.73）μmol/L（見(jiàn)圖1）。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，五味子丙素也能以濃度劑量依賴性地抑制AGS細(xì)胞生長(zhǎng)，在濃度為20 μmol/L時(shí)對(duì)集落的形成就具有很好的抑制作用（見(jiàn)圖2）。

圖2 五味子丙素對(duì)AGS集落形成的影響

2.2 五味子丙素誘導(dǎo)AGS凋亡 流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子丙素在40 μmol/L時(shí)就能明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，其在濃度為40 μmol/L和60 μmol/L時(shí)細(xì)胞總凋亡率分別為32.1%和38.4%，晚期凋亡率分別為20.9%和22.8%，因此主要表現(xiàn)為晚期凋亡（見(jiàn)圖3）。

2.3 五味子丙素對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)五味子丙素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的五味子丙素孵育細(xì)胞24 h后就能夠明顯上調(diào)凋亡蛋白Cleaved-PARP，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（見(jiàn)圖4A）；不同濃度梯度的五味子丙素孵育細(xì)胞后，對(duì)Cleaved-PARP和Bcl-2的影響呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，在40 μmol/L下就表現(xiàn)出明顯的活性（見(jiàn)圖4B）。但是，五味子丙素對(duì)凋亡蛋白Bax的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響。

圖3 五味子丙素對(duì)AGS凋亡的影響

2.4 五味子丙素對(duì)5-FU的增敏活性 用MTT法進(jìn)一步研究了五味子丙素對(duì)5-FU的增敏活性。結(jié)果顯示設(shè)置的9 個(gè)聯(lián)合用藥濃度組合均具有比相應(yīng)單藥更強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活性（其中五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L和五味子丙素40 μmol/L+5-FU 2 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 2 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 3 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 3 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 4 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素20 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素20 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素20 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L、五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素30 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素40 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可知五味子丙素表現(xiàn)了較好地增敏5-FU的抗胃癌活性。

3 討論

圖4 五味子丙素不同時(shí)間（A）和不同濃度（B）孵育對(duì)AGS凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 五味子丙素增敏5-FU的抗胃癌活性

五味子是一種在我國(guó)應(yīng)用最廣泛的滋補(bǔ)中藥之一，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列五味子為上品，藥用價(jià)值極高，能滋補(bǔ)強(qiáng)壯之力，有強(qiáng)身健體之效。五味子的主要活性成分為木質(zhì)素，主要包括五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素[8]。研究顯示，五味子的保護(hù)心臟和心血管、肝臟等作用與木質(zhì)素類(lèi)的抗炎、抗氧化活性密切相關(guān)[8]。近年來(lái)的研究顯示，木質(zhì)素類(lèi)成分也具有良好的抗腫瘤活性，其中五味子乙素和五味子甲素都有較多的研究報(bào)道。如五味子乙素對(duì)肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤均具有較好的體外抗腫瘤活性[9]；對(duì)膠質(zhì)瘤、乳腺癌具有良好的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性[9]；五味子甲素對(duì)膽管癌[10]、結(jié)腸癌[11]、乳腺癌[12]、胰腺癌[13]均具有良好的體外腫瘤活性，對(duì)肺癌具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性[14]。而五味子丙素抗腫瘤活性的研究報(bào)道極少，目前僅PARK等[15]報(bào)道其通過(guò)抑制U937細(xì)胞的生長(zhǎng)、阻滯周期和誘導(dǎo)凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤活性；LU等[16]報(bào)道其能較好地抑制肝癌細(xì)胞（Bel-7402）的生長(zhǎng)[IC50=（81.58±1.06）μmol/L]。本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素能較好地抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并能夠明顯影響凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved-PARP、Bcl-2）的表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

靶向藥物是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，目前已有多種該類(lèi)藥物上市。但是，胃癌的靶向藥物極少，應(yīng)用于臨床的僅有HER2抑制劑曲妥珠單抗和VEGFR抑制劑雷莫蘆單抗，這導(dǎo)致了目前從靶向藥物獲益的胃癌患者極其有限[1]。因此胃癌化療的一線主要用藥仍然是氟尿嘧啶等經(jīng)典細(xì)胞毒類(lèi)化療藥物，而該類(lèi)藥物的選擇性差，在靶向腫瘤的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞核組織也具有很大的殺傷作用，不良反應(yīng)非常大[1]。聯(lián)合用藥是解決此類(lèi)問(wèn)題的有效策略，最理性的聯(lián)合藥物應(yīng)該是：能夠?qū)熕幬镌雒簦也辉黾硬涣挤磻?yīng)，甚至可以降低化療不良反應(yīng)。但是，目前一般的聯(lián)合用藥策略均注重增敏，而安全性被忽略了，因此聯(lián)合用藥會(huì)帶來(lái)更大的不良反應(yīng)。從具有器官保護(hù)作用的藥物中挖掘聯(lián)合用藥藥物是最佳策略，如五味子乙素能使實(shí)驗(yàn)小鼠的心臟免受抗腫瘤藥物多柔比星引起的不良反應(yīng)，對(duì)鉑類(lèi)化合物引起的腎臟毒性具有緩解作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素具有很好地增敏5-FU的體外抗胃癌活性。由于五味子丙素對(duì)肝臟等器官也具有很好的保護(hù)作用，預(yù)期其對(duì)胃癌化療增敏的同時(shí)，極大可能也會(huì)具有降低氟尿嘧啶類(lèi)化療毒性的作用，但其體內(nèi)增敏和降低不良反應(yīng)的藥效還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素不僅具有較好的體外抗胃癌活性，也具有明顯增敏胃癌化療的作用，可能成為低毒的胃癌化療候選新藥。