張嬋，譚玉杰，李希聰，王灝

(1.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 生殖中心，河南 洛陽 471000；2.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 產(chǎn)科，河南 洛陽 471000)

妊娠期高血壓(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是全世界孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一，發(fā)病率為2%～7%[1]。有研究表明內(nèi)皮功能障礙、脂代謝異常是HDCP發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，臨床及早識(shí)別和發(fā)現(xiàn)、早期排查、篩選HDCP的危險(xiǎn)因素、做好早預(yù)防及預(yù)警變得尤為重要[2]。目前，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospolipase A2，Lp-PLA2)被認(rèn)為是心血管事件的獨(dú)立因子[3-4]，與高血壓、血脂異常及高膽固醇血癥等心血管事件具有一定的相關(guān)性[4]，但關(guān)于Lp-PLA2基因位點(diǎn)多態(tài)與HDCP的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究通過分析Lp-PLA2基因多態(tài)性位點(diǎn)rs1051931、rs1421378、rs1805017及rs16874954在子癇前期及HDCP人群的分布，探討其與子癇前期、HDCP的關(guān)系，為臨床提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年10月—2019年7月常規(guī)產(chǎn)檢并住院232例待產(chǎn)孕婦，根據(jù)病情分為輕度子癇前期(mild preeclampsia，mPE)組68例，重度子癇前期(severe preeclampsia，sPE)組60例，HDCP組32例；選取同期待產(chǎn)的132例健康孕婦作為對(duì)照組。4組孕婦平均年齡分別為(29.53±5.12)歲、(31.12±4.23)歲、(31.34±4.43)歲及(30.32±4.34)歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有入組孕婦均同意并簽署知情同意書參與本研究，孕前均無慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝臟疾病，mPE、sPE及HDCP的診斷參考文獻(xiàn)[5]。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 孕婦入院時(shí)，采集晨起空腹外周靜脈血5 mL，同時(shí)測(cè)量血壓、收集24 h尿液進(jìn)行24 h尿蛋白定量檢測(cè)。外周靜脈血采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝、3 000 r/min離心10 min，檢測(cè)空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(INS)、甘油三脂(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDLC)、低密度脂蛋白(LDLC)水平，收集血細(xì)胞用于Lp-PLA2水平的檢測(cè)。

1.2.2基因組DNA的提取及質(zhì)量控制 取分離的血細(xì)胞，采用北京天根生化科技公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，提取方法按照說明書進(jìn)行操作。提取的DNA采用分光光度法檢測(cè)濃度和純度，取DNA溶液5 μL，采用 1%瓊脂糖電泳鑒定DNA完整無降解，可以滿足PCR要求。

1.2.3Lp-PLA2基因rs1051931、rs1421378、rs1805017及rs16874954位點(diǎn)的檢測(cè) 采用Sanger測(cè)序法，首先使用美國AB Verity 96well儀器進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用AB公司生產(chǎn)的3730XL測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)使用primer5軟件，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為20～50 μg/L模板DNA 1 μL，10 μmol/L上下游引物 2 μL，10 mmol/L DNTP mix 2 μL，10×Taq Buffer (with MgCl2) 5 μL，5 U/μL Taq酶 0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足體積至50 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。測(cè)序反應(yīng)體系為10 μg/L的純化PCR產(chǎn)物1 μL，2.5×BigDye 4 μL，5×BigDye Seq Buffer 2 μL，3.2 nmol/L測(cè)序引物1 μL，加ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL；測(cè)序反應(yīng)條件為96 ℃ 1 min、96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s及60 ℃ 4 min，25個(gè)循環(huán)，4 ℃保溫。

表1 Lp-PLA2基因4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的引物序列及擴(kuò)增片段長度Tab.1 Primer sequences for detecting Lp-PLA2 polymorphism and amplified fragment lengths

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般資料及血脂指標(biāo)

結(jié)果顯示，mPE組、sPE組及對(duì)照組孕婦入院時(shí)的收縮壓及舒張壓低于HDCP組(P<0.05)，mPE組、sPE組及HDCP組孕婦TC、TG、LDLC高于對(duì)照組、HDLC低于對(duì)照組(P<0.05)，mPE組、sPE組及HDLC組Lp-PLA 2 h和24 h蛋白尿含量高于對(duì)照組(P<0.05)，mPE組Lp-PLA 2 h和24 h蛋白尿含量低于sPE組(P<0.05)。見表2。

表2 各組孕婦的一般資料及血脂指標(biāo)Tab.2 Comparison of general data and the levels of blood lipid and urine protein in pregnant women in each group

2.2 Lp-PLA2基因分型測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，Lp-PLA2基因rs1051931位點(diǎn)存在等位基因A和G，有AA(突變純合子)、AG(突變雜合子)及GG(野生型) 3種基因型(圖1A)；rs1421378位點(diǎn)存在等位基因A和G，有AA(野生型)、AG(突變雜合子)、GG(突變純合子) 3種基因型(圖1B)；rs1805017位點(diǎn)存在等位基因A和G，有AA(突變純合子)、AG(突變雜合子)、GG(野生型)3種基因型(圖1C)；rs16874954位點(diǎn)存在等位基因A和C，有AC、CC，2種基因型(圖1D)。

2.3 Lp-PLA2基因的基因型構(gòu)成及等位基因頻率

結(jié)果顯示，4組孕婦Lp-PLA2基因rs1051931、rs1421378、rs1805017及rs16874954位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.047、2.058、0.120、1.210，P>0.05)，見表3。如表4所示，Lp-PLA2基因rs1051931、rs1421378及rs1805017位點(diǎn)基因型AA、AG、GG頻率分布在4組孕婦比較差異無意義(χ2=0.790、2.058、4.701，P>0.05)，Lp-PLA2基因rs16874954位點(diǎn)基因型CC、AC在mPE組和對(duì)照組比較、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.8，P=0.03)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，攜帶CC基因發(fā)生妊娠期子癇和高血壓疾病風(fēng)險(xiǎn)高于AC型(OR=2.139，95%CI為1.024～4.458)。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium result of Lp-PLA2 gene

表4 各組孕婦Lp-PLA2基因4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型構(gòu)成及等位基因頻率Tab.4 The frequencies of genotypes and alleles of Lp-PLA2 gene polymorphism in each group

注：A為rs1051931位點(diǎn)，B為rs1421378，C為rs16874954位點(diǎn)，D為rs1805017位點(diǎn)。圖1 Lp-PLA2基因4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果Fig.1 The sequencing results of four SNP sites of Lp-PLA2 gene

2.4 子癇前期及HDCP孕婦Lp-PLA2基因4個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)與血脂指標(biāo)的關(guān)系

結(jié)果顯示，rs1805017位點(diǎn)AG+AA基因型孕婦HDLC低于GG基因型、TG高于GG基因型(P<0.05)；rs16874954位點(diǎn)CC基因型孕婦TG、Lp-PLA2高于AC型 (P<0.05)、HDLC低于AC型，其余血脂水平在不同基因型孕婦間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見表5。

表5 子癇前期及HDCP孕婦Lp-PLA2基因4個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與血脂指標(biāo)的關(guān)系Tab.5 Correlation between genotypes of Lp-PLA2 gene polymorphism and blood lipid index

2.5 子癇前期和HDCP孕婦Lp-PLA2基因4個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)及血脂指標(biāo)的多因素Logistic回歸分析

結(jié)果顯示，rs16874954位點(diǎn)突變與子癇前期、妊娠期高血壓易感性密切相關(guān)，是子癇前期和妊娠期高血壓發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.672，95%CI為1.187～2.231)；其余3個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)與子癇前期、妊娠期高血壓發(fā)病無相關(guān)性。見表6。

表6 Lp-PLA2基因多態(tài)性位點(diǎn)與子癇前期、妊娠期高血壓易感性多因素Logistic回歸分析Tab.6 Multivariate Logistic regression analysis of the risk factors among Lp-PLA2 gene polymorphism,lipid levels for the susceptibility to PE and HDCP

3 討論

Lp-PLA2是一種新型的與AS相關(guān)的、由炎癥細(xì)胞合成與分泌的炎癥標(biāo)記物，屬于磷脂酶 A2超家族中的非鈣離子依賴型磷脂酶A2(iPLA2)，由441個(gè)氨基酸殘基組成。Lp-PLA2由血管內(nèi)膜浸潤的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞合成并分泌，大部分與LDL-C結(jié)合，少部分與HDL-C結(jié)合，以復(fù)合物形式在血漿中循環(huán)[6]，通過水解氧化磷脂生成溶血磷脂膽堿和氧化非酯化脂肪酸，誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7]。由于妊娠體內(nèi)激素的改變，導(dǎo)致體內(nèi)血脂有所改變，血脂水平過高，易導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物的增加，抗氧化物質(zhì)無法清除而產(chǎn)生過多的氧化物質(zhì)及自由基，導(dǎo)致子癇前期發(fā)生[8]。

根據(jù)大型的全基因組關(guān)聯(lián)研究，Lp-PLA2被認(rèn)為是可遺傳的心血管危險(xiǎn)因素[9-11]。子癇前期及HCDP和動(dòng)脈粥樣硬化具有相似的病理生理途徑，并且Lp-PLA2與內(nèi)皮功能障礙之間的關(guān)系在PE發(fā)病機(jī)制中得到關(guān)注。正常妊娠也表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的變化，包括氧化應(yīng)激、補(bǔ)體激活、分泌血管收縮劑、微血栓形成、梗塞及血栓烷水平升高。最近研究表明，這種炎癥可導(dǎo)致局部和全身性變化，與子癇前期和HCDP相關(guān)，對(duì)血流和動(dòng)脈壓產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[9]。

Lp-PLA2定位在6號(hào)染色體p21.2-p12，本研究調(diào)查了Lp-PLA2基因多態(tài)性與先兆子癇和妊高癥患者相關(guān)性的關(guān)系。結(jié)果顯示研究中人群中rs1051931、rs1421378、rs1805017位點(diǎn)的基因型主要為GG+AG，AA+AG，GG+AG[12-13]。rs1801517、rs1051931位點(diǎn)屬于非同義突變，既往研究與冠心病有明顯相關(guān)性[14]。上述3個(gè)位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs16874954位點(diǎn)研究人群出現(xiàn)CC和AC兩種基因型[15]，有研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群rs16874954位點(diǎn)基因突變降低LP-PLA2的活性[16]。在此基礎(chǔ)上，研究又進(jìn)一步分析不同基因型PE和HCDP患者血脂水平的差異。rs1805017位點(diǎn)AG+AA基因型患者HDLC水平明顯低于GG基因型患者，TG水平高于GG基因型患者(P<0.05)；而rs16874954位點(diǎn)CC基因型患者TG、Lp-PLA2水平明顯高于AC型患者(P<0.05)；HDLC水平低于AC型。其余血脂水平在不同基因型患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明rs1805017和rs16874954位點(diǎn)的基因多態(tài)性影響PE和HCDP患者的血脂水平[3，17-18]，本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期和HCDP孕婦的TG、TC及LDL-C水平高于對(duì)照組，與岑慧等[19]的研究一致?；蛭稽c(diǎn)多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致疾病發(fā)展程度不同，提示這部分基因分型可作為子癇前期和HCDP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，rs168749547位點(diǎn)突變與子癇前期、妊娠期高血壓易感性密切相關(guān)，該rs16874954位點(diǎn)突變可能和環(huán)境共同作用下致病，提示rs16874954位點(diǎn)多態(tài)性突變可能是子癇前期和HCDP發(fā)病的因素。

綜上所述，本次研究對(duì)子癇前期和HDCP人群進(jìn)行Lp-PLA2基因多態(tài)性進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)rs16874954位點(diǎn)突變與子癇前期、HCDP易感性密切相關(guān)，rs16874954多態(tài)性位點(diǎn)影響血脂代謝可能與子癇前期和HDCP發(fā)生有關(guān)。另外rs1684954位點(diǎn)只發(fā)現(xiàn)2種基因型，而AA在人群中存在頻率低。推測(cè)本研究由于樣本量偏少，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。