黃麗，康哲，翟素珍，張春林，蔡莉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物學(xué)系，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市白云區(qū)醫(yī)院 婦產(chǎn)科，貴州 貴陽 550014)

肺癌是我國乃至全世界發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌中最主要的病理類型，占所有肺癌患者的80%～85%[1]，其治療亦是全球性的一大難題[2-4]。近年來，中藥治療與手術(shù)、放療及化療相比，具有多環(huán)節(jié)、多成分、多靶點效應(yīng)及減毒增效的優(yōu)勢[5-8]。美洲大蠊(periplanetaamericanaL.)俗稱“蟑螂”，是一種蜚蠊科昆蟲[9]。美洲大蠊入藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已經(jīng)記載[10]，至今以其為原料已研制出多種新藥，如心脈龍注射液、康復(fù)新液、肝龍膠囊及癥益肝片等[11]。眾多研究表明，美洲大蠊提取物(periplanetaamericanaextract,PAE)具有抗氧化、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等廣泛的藥理活性[12-14]。目前PAE在肺癌方面的研究少有報道[15]，且具體的作用機制尚不完全清楚。本研究以人LUAD HCC-2935細(xì)胞為研究對象，探究PAE對HCC-2935細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響，為PAE應(yīng)用于LUAD的臨床治療提供新的基礎(chǔ)理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與成蟲 人LUAD細(xì)胞株HCC-2935由貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室惠贈，美洲大蠊成蟲取自貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)系蜚蠊養(yǎng)殖房，PAE經(jīng)90%乙醇冷浸提取獲得。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco)，胰蛋白酶和胎牛血清(美國Sigma)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342/PI(propidium iodide，PI)雙染試劑盒(北京Solarbio)，順鉑(上海恒遠(yuǎn))；ELX808酶標(biāo)儀(瑞士寶特)，BDS200倒置生物學(xué)顯微鏡(重慶奧特)，流式細(xì)胞儀(美國NovoCyte)，371直熱式CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo)，QL 901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人LUAD細(xì)胞HCC-2935使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使細(xì)胞均勻貼壁生長，取生長良好、形態(tài)均一的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗，并分為對照組、PAE組及順鉑組。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期各組細(xì)胞調(diào)整為1×108個/L的細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；PAE組細(xì)胞中分別加50、100及200 mg/L PAE，對照組細(xì)胞加等體積濃度含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，順鉑組細(xì)胞加等體積濃度的40 mg/L順鉑，每個濃度設(shè)置5個副孔，培養(yǎng)24、48 h；每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加DMSO 150 μL，震蕩混勻，酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度(optical density，OD)；每組重復(fù)3次實驗，計算各組細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%]，篩選出給藥的有效作用時間。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞按2×105個/孔接種于6孔板，置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和40 mg/L順鉑加入各組對應(yīng)孔；給藥作用48 h后，采用胰酶消化并收集各組細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次，分別加Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)各5 μL，室溫避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率；每組重復(fù)3次，取其細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞按3×104個/孔接種于6孔板中，將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和40 mg/L順鉑加入各組對應(yīng)孔中；給藥處理48 h后，采用胰酶消化并收集各組細(xì)胞，PBS洗滌，用預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過夜；PBS洗去殘留的乙醇，PI低于4 ℃的避光條件下細(xì)胞染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的生長發(fā)育周期變化。每組重復(fù)3次實驗，計算染色平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料組間比較使用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

MTT法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度的PAE組和順鉑組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.01)；在同一時間點隨PAE濃度的增加，HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P<0.01)；相同PAE濃度時，各組作用48 h的抑制效應(yīng)較作用24 h明顯增強(P<0.01)，顯示PAE抑制HCC-2935細(xì)胞的增殖呈時間-劑量依賴性；24和48 h作用時間下200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率較順鉑組明顯上調(diào)(P<0.01)。因此，在后續(xù)研究中選取給藥48 h作為研究的有效作用時間點。見表1。

表1 各組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of HCC-2935 cells in each

2.2 細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，50、100及200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞凋亡率逐漸升高，呈劑量依賴性(P<0.01)；其中200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞凋亡率較順鉑組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與順鉑組比較，P<0.01。圖1 各組HCC-2935細(xì)胞凋亡率 Fig.1 Effects of different concentrations of PAE on apoptosis of LUAD HCC-2935 cells

2.3 細(xì)胞周期

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，40 mg/L順鉑組HCC-2935細(xì)胞于G0/G1期所占百分比升高，在S期和G2/M期的百分比降低(P<0.05)，表明細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期；50、100及200 mg/LPAE組HCC-2935細(xì)胞于G0/G1期和S期的百分比較對照組降低，在G2/M期細(xì)胞所占百分比較對照組升高(P<0.05)，推測細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。見圖2。

注：與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.001。圖2 不同濃度PAE對HCC-2935細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of PAE on the cycle of HCC-2935 cells

3 討論

目前LUAD的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，主要在于其術(shù)后復(fù)發(fā)性高、耐藥性及高轉(zhuǎn)移性[16]。以順鉑為代表的鉑類聯(lián)合其他化療藥物是臨床治療LUAD的一線方案[17]，雖然多數(shù)患者在化療初期對藥物敏感，但后期療效欠佳，鉑類耐藥已成為臨床治療LUAD的難題[18]。因此，臨床迫切需要毒副作用低、治療效果好且逆轉(zhuǎn)耐藥的LUAD化療藥物。

美洲大蠊作為世界上最古老的昆蟲，能適應(yīng)各種陰暗惡劣環(huán)境，在數(shù)億年的進(jìn)化歷程中其體內(nèi)必形成了獨特防御機制的某些特殊生化物質(zhì)[19]。純天然蟲類中藥材美洲大蠊逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其提取物在多種腫瘤中被證實具有較好的抗腫瘤活性[20-22]。如劉童婷等[23]認(rèn)為PAE可抑制結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞增殖，具有誘導(dǎo)HCT 116細(xì)胞凋亡的作用；楊蕊菲等[24]研究指出，PAE可能通過下調(diào)Ras/Raf/ERK1/2信號通路誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。由此可見，PAE可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機制來調(diào)控腫瘤的惡性進(jìn)展。鑒于PAE在肺癌臨床治療中的實驗依據(jù)還不夠充分，具體的作用機制尚不完全清楚，故本課題組開展了相關(guān)研究。本研究的結(jié)果與上述研究相符，結(jié)果顯示PAE對LUAD HCC-2935細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加逐漸增強，且作用48 h的抑制效應(yīng)較24 h明顯增強，提示PAE能夠呈時間-劑量依賴性有效抑制LUAD HCC-2935細(xì)胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度(200 mg/L)PAE的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于40 mg/L順鉑，提示天然中藥美洲大蠊抑制LUAD細(xì)胞具有增效減毒的作用，為PAE在腫瘤化療中作為輔助用藥提供了試驗依據(jù)。臨床治療中可考慮PAE聯(lián)合鉑類藥物治療LUAD，以增加抗腫瘤治療敏感性。

細(xì)胞凋亡為一個多基因、多階段和多途徑共同作用的復(fù)雜過程，細(xì)胞凋亡的異常是導(dǎo)致細(xì)胞不能程序性死亡而影響腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素之一[25]。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂亦可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖[26]。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示低、中、高濃度的PAE處理LUAD HCC-2935細(xì)胞48 h后，其細(xì)胞凋亡率逐漸升高，另細(xì)胞于G0/G1期和S期所占百分比較對照組明顯降低，而在G2/M期所占百分比較對照組明顯升高，提示PAE呈劑量依賴性誘導(dǎo)LUAD HCC-2935細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞被阻滯于G2/M期。這與王晶[27]報道的PAE可誘導(dǎo)肺癌 H125細(xì)胞凋亡，阻滯肺癌H125細(xì)胞于S期的結(jié)果不相吻合，推測與研究的細(xì)胞株及細(xì)胞所處的周期不相同有關(guān)。

本研究是在體外環(huán)境下探討PAE對人LUAD HCC-2935 細(xì)胞增殖與凋亡的作用，但機體內(nèi)存在諸如酶活性、代謝等影響因素，故PAE在體內(nèi)環(huán)境中抑制LUAD細(xì)胞增殖的作用機制、細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號通路及分子靶點還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。