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        美洲大蠊提取物對人肺腺癌HCC-2935細(xì)胞增殖和凋亡及周期的影響*

        2021-04-13 07:10:00黃麗康哲翟素珍張春林蔡莉
        關(guān)鍵詞:美洲百分比抑制率

        黃麗,康哲,翟素珍,張春林,蔡莉

        (1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生物學(xué)系,貴州 貴陽 550025;2.貴陽市白云區(qū)醫(yī)院 婦產(chǎn)科,貴州 貴陽 550014)

        肺癌是我國乃至全世界發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤,其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌中最主要的病理類型,占所有肺癌患者的80%~85%[1],其治療亦是全球性的一大難題[2-4]。近年來,中藥治療與手術(shù)、放療及化療相比,具有多環(huán)節(jié)、多成分、多靶點(diǎn)效應(yīng)及減毒增效的優(yōu)勢[5-8]。美洲大蠊(periplanetaamericanaL.)俗稱“蟑螂”,是一種蜚蠊科昆蟲[9]。美洲大蠊入藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中已經(jīng)記載[10],至今以其為原料已研制出多種新藥,如心脈龍注射液、康復(fù)新液、肝龍膠囊及癥益肝片等[11]。眾多研究表明,美洲大蠊提取物(periplanetaamericanaextract,PAE)具有抗氧化、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等廣泛的藥理活性[12-14]。目前PAE在肺癌方面的研究少有報(bào)道[15],且具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究以人LUAD HCC-2935細(xì)胞為研究對象,探究PAE對HCC-2935細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響,為PAE應(yīng)用于LUAD的臨床治療提供新的基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1細(xì)胞株與成蟲 人LUAD細(xì)胞株HCC-2935由貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),美洲大蠊成蟲取自貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)系蜚蠊養(yǎng)殖房,PAE經(jīng)90%乙醇冷浸提取獲得。

        1.1.2主要試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco),胰蛋白酶和胎牛血清(美國Sigma),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、四唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞凋亡熒光Hoechst 33342/PI(propidium iodide,PI)雙染試劑盒(北京Solarbio),順鉑(上海恒遠(yuǎn));ELX808酶標(biāo)儀(瑞士寶特),BDS200倒置生物學(xué)顯微鏡(重慶奧特),流式細(xì)胞儀(美國NovoCyte),371直熱式CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo),QL 901旋渦振蕩器(海門市麒麟醫(yī)用儀器)。

        1.2 方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人LUAD細(xì)胞HCC-2935使用含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),使細(xì)胞均勻貼壁生長,取生長良好、形態(tài)均一的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),并分為對照組、PAE組及順鉑組。

        1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期各組細(xì)胞調(diào)整為1×108個(gè)/L的細(xì)胞懸液,按100 μL/孔接種于96孔板,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜;PAE組細(xì)胞中分別加50、100及200 mg/L PAE,對照組細(xì)胞加等體積濃度含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,順鉑組細(xì)胞加等體積濃度的40 mg/L順鉑,每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)副孔,培養(yǎng)24、48 h;每孔加5 g/L MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液,加DMSO 150 μL,震蕩混勻,酶標(biāo)儀于490 nm處測定吸光度(optical density,OD);每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率[細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100%],篩選出給藥的有效作用時(shí)間。

        1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板,置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和40 mg/L順鉑加入各組對應(yīng)孔;給藥作用48 h后,采用胰酶消化并收集各組細(xì)胞,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,分別加Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide,PI)各5 μL,室溫避光孵育30 min,采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率;每組重復(fù)3次,取其細(xì)胞數(shù)的平均值。

        1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞按3×104個(gè)/孔接種于6孔板中,將不同濃度的PAE、含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和40 mg/L順鉑加入各組對應(yīng)孔中;給藥處理48 h后,采用胰酶消化并收集各組細(xì)胞,PBS洗滌,用預(yù)冷的70%乙醇4 ℃固定過夜;PBS洗去殘留的乙醇,PI低于4 ℃的避光條件下細(xì)胞染色30 min,用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的生長發(fā)育周期變化。每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),計(jì)算染色平均值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料組間比較使用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)胞增殖

        MTT法檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,不同濃度的PAE組和順鉑組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.01);在同一時(shí)間點(diǎn)隨PAE濃度的增加,HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高(P<0.01);相同PAE濃度時(shí),各組作用48 h的抑制效應(yīng)較作用24 h明顯增強(qiáng)(P<0.01),顯示PAE抑制HCC-2935細(xì)胞的增殖呈時(shí)間-劑量依賴性;24和48 h作用時(shí)間下200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率較順鉑組明顯上調(diào)(P<0.01)。因此,在后續(xù)研究中選取給藥48 h作為研究的有效作用時(shí)間點(diǎn)。見表1。

        表1 各組HCC-2935細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Comparison of proliferation inhibition rates of HCC-2935 cells in each

        2.2 細(xì)胞凋亡

        流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,50、100及200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞凋亡率逐漸升高,呈劑量依賴性(P<0.01);其中200 mg/L PAE組HCC-2935細(xì)胞凋亡率較順鉑組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

        注:(1)與對照組比較,P<0.01;(2)與順鉑組比較,P<0.01。圖1 各組HCC-2935細(xì)胞凋亡率 Fig.1 Effects of different concentrations of PAE on apoptosis of LUAD HCC-2935 cells

        2.3 細(xì)胞周期

        流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,40 mg/L順鉑組HCC-2935細(xì)胞于G0/G1期所占百分比升高,在S期和G2/M期的百分比降低(P<0.05),表明細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期;50、100及200 mg/LPAE組HCC-2935細(xì)胞于G0/G1期和S期的百分比較對照組降低,在G2/M期細(xì)胞所占百分比較對照組升高(P<0.05),推測細(xì)胞周期被阻滯于G2/M期。見圖2。

        注:與對照組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001。圖2 不同濃度PAE對HCC-2935細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of PAE on the cycle of HCC-2935 cells

        3 討論

        目前LUAD的發(fā)病率和死亡率一直居高不下,主要在于其術(shù)后復(fù)發(fā)性高、耐藥性及高轉(zhuǎn)移性[16]。以順鉑為代表的鉑類聯(lián)合其他化療藥物是臨床治療LUAD的一線方案[17],雖然多數(shù)患者在化療初期對藥物敏感,但后期療效欠佳,鉑類耐藥已成為臨床治療LUAD的難題[18]。因此,臨床迫切需要毒副作用低、治療效果好且逆轉(zhuǎn)耐藥的LUAD化療藥物。

        美洲大蠊作為世界上最古老的昆蟲,能適應(yīng)各種陰暗惡劣環(huán)境,在數(shù)億年的進(jìn)化歷程中其體內(nèi)必形成了獨(dú)特防御機(jī)制的某些特殊生化物質(zhì)[19]。純天然蟲類中藥材美洲大蠊逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,其提取物在多種腫瘤中被證實(shí)具有較好的抗腫瘤活性[20-22]。如劉童婷等[23]認(rèn)為PAE可抑制結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞增殖,具有誘導(dǎo)HCT 116細(xì)胞凋亡的作用;楊蕊菲等[24]研究指出,PAE可能通過下調(diào)Ras/Raf/ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡,抑制其增殖。由此可見,PAE可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制來調(diào)控腫瘤的惡性進(jìn)展。鑒于PAE在肺癌臨床治療中的實(shí)驗(yàn)依據(jù)還不夠充分,具體的作用機(jī)制尚不完全清楚,故本課題組開展了相關(guān)研究。本研究的結(jié)果與上述研究相符,結(jié)果顯示PAE對LUAD HCC-2935細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的增加逐漸增強(qiáng),且作用48 h的抑制效應(yīng)較24 h明顯增強(qiáng),提示PAE能夠呈時(shí)間-劑量依賴性有效抑制LUAD HCC-2935細(xì)胞增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)高濃度(200 mg/L)PAE的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于40 mg/L順鉑,提示天然中藥美洲大蠊抑制LUAD細(xì)胞具有增效減毒的作用,為PAE在腫瘤化療中作為輔助用藥提供了試驗(yàn)依據(jù)。臨床治療中可考慮PAE聯(lián)合鉑類藥物治療LUAD,以增加抗腫瘤治療敏感性。

        細(xì)胞凋亡為一個(gè)多基因、多階段和多途徑共同作用的復(fù)雜過程,細(xì)胞凋亡的異常是導(dǎo)致細(xì)胞不能程序性死亡而影響腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素之一[25]。細(xì)胞周期調(diào)控紊亂亦可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖[26]。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測,結(jié)果顯示低、中、高濃度的PAE處理LUAD HCC-2935細(xì)胞48 h后,其細(xì)胞凋亡率逐漸升高,另細(xì)胞于G0/G1期和S期所占百分比較對照組明顯降低,而在G2/M期所占百分比較對照組明顯升高,提示PAE呈劑量依賴性誘導(dǎo)LUAD HCC-2935細(xì)胞凋亡,且細(xì)胞被阻滯于G2/M期。這與王晶[27]報(bào)道的PAE可誘導(dǎo)肺癌 H125細(xì)胞凋亡,阻滯肺癌H125細(xì)胞于S期的結(jié)果不相吻合,推測與研究的細(xì)胞株及細(xì)胞所處的周期不相同有關(guān)。

        本研究是在體外環(huán)境下探討PAE對人LUAD HCC-2935 細(xì)胞增殖與凋亡的作用,但機(jī)體內(nèi)存在諸如酶活性、代謝等影響因素,故PAE在體內(nèi)環(huán)境中抑制LUAD細(xì)胞增殖的作用機(jī)制、細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路及分子靶點(diǎn)還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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