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        肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的制備及其體外釋放性能*

        2021-04-13 07:10:00陳思憶李莉胡一新麥小斌黃家宇
        關(guān)鍵詞:釋藥卵磷脂肝素鈉

        陳思憶,李莉,胡一新,麥小斌,黃家宇*

        (1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 骨科,貴州 貴陽(yáng) 550004;3.廣東藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,廣東 廣州 510006)

        下肢深靜脈血栓(lower extremity deep venous thrombosis,DVT)是一種靜脈內(nèi)血凝塊阻塞而引起的周?chē)懿。@^發(fā)于創(chuàng)傷、分娩、腫瘤及手術(shù)等,是骨科手術(shù)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥[1-2],且易導(dǎo)致肺栓塞,嚴(yán)重者甚至危及生命[3-4]。肝素(heparin,Hep)是一種經(jīng)典的抗凝血藥物[5],臨床上常用于預(yù)防血栓的形成和治療急性靜脈血栓[6-7],但是目前肝素在預(yù)防DVT時(shí)存在一些明顯的缺陷,如注射后出血、藥效作用時(shí)間短、給藥頻繁及病人順應(yīng)性差等[8],造成肝素的使用受到了限制,因此肝素緩釋材料研究逐漸受到關(guān)注。目前肝素緩釋材料主要有肝素緩釋微球和載肝素組織工程材料,Amit等[9]利用肝素乳化工藝制得肝素緩釋微囊,使得改良后肝素緩釋微球的藥物半衰期遠(yuǎn)高于一般肝素;國(guó)內(nèi)研究結(jié)果表明,制備肝素緩釋組織工程材料可達(dá)到良好的肝素緩釋效果[10-11]。脂質(zhì)體(liposomes)是指兩親性磷脂和膽固醇分子形成的相互間隔、定向排列組成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡[12],將藥物包封于類(lèi)脂質(zhì)雙分子層內(nèi)能讓藥物具有緩慢釋放、降低毒性及改變給藥途徑等優(yōu)點(diǎn)[13]。溫敏水凝膠(thermosensitive hydrogels)是一類(lèi)對(duì)溫度變化敏感的高分子聚合物材料,在體外相較體溫較低時(shí)呈液態(tài),而在體內(nèi)則呈固態(tài),可通過(guò)局部注射到達(dá)人體病患部位,發(fā)揮靶向治療作用,還可維持體內(nèi)的血藥濃度,降低不良反應(yīng),減少給藥次數(shù)和血藥濃度的波動(dòng),發(fā)揮緩慢釋放的作用[14-15]。因此,本研究用大豆卵磷脂和膽固醇作為脂質(zhì)體的膜材,用人體可降解吸收的天然高分子材料殼聚糖作為凝膠載體材料,制備一種安全無(wú)毒的肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠皮下緩釋注射劑,期望能為肝素治療DVT提供一種改良的給藥途徑。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1藥材來(lái)源 肝素鈉(效價(jià)195.8 IU=1 mg,批號(hào)NHS180403,河北常山生化藥業(yè)股份有限公司),亞甲基藍(lán)(批號(hào)61734,大連美倫生物技術(shù)有限公司)。

        1.1.2主要儀器 AUY120型電子分析天平、UV2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司),DK-98-ⅡA型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司),HNY-100B型智能恒溫培養(yǎng)振蕩器(天津歐諾儀器股份有限公司),B-490型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦公司),TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

        1.1.3主要試劑 脫乙酰度95%的殼聚糖(chitosan,CS;批號(hào)9012764)和膽固醇(批號(hào)57885,大連美倫生物技術(shù)有限公司),β-甘油磷酸鈉(β-sodium glycerophosphate,β-GP,批號(hào)1120H031)和大豆卵磷脂(批號(hào)420H021,北京索萊寶生物科技有限公司),二氯甲烷(分析純,批號(hào)20160630,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),實(shí)驗(yàn)用水均為純化水。

        1.2 方法

        1.2.1肝素鈉溶液和亞甲基藍(lán)溶液的配制 精密稱(chēng)取肝素鈉0.025 5 g和亞甲基藍(lán)0.048 0 g,分別置于100 mL容量瓶中,純水定容至刻度配制成50 000 IU/L和0.48 g/L儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液加純水分別稀釋得1 000 IU/L肝素鈉溶液和0.24 g/L亞甲基藍(lán)溶液。

        1.2.2專(zhuān)屬性 取一定濃度的肝素鈉、空白制劑分別與亞甲基藍(lán)溶液進(jìn)行反應(yīng),于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)400~800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行紫外掃描,確定其最大吸收波長(zhǎng)。

        1.2.3線性關(guān)系與定量限、檢測(cè)限 取“1.2.1”項(xiàng)下肝素鈉溶液,純水依次稀釋濃度為250、200、150、100及50 IU/L,加亞甲基藍(lán)溶液配成0.024 g/L濃度,得供試品;于664 nm處測(cè)定試劑空白吸光度值(A0),不同濃度肝素鈉溶液吸光度值(An),△A=A0-An,以濃度(C)作為x軸,吸光度(△A)作為y軸,作線性回歸,計(jì)算其定量限與檢測(cè)限。

        1.2.4穩(wěn)定性、精密度與重復(fù)性 取“1.2.3”項(xiàng)下高、中及低(250、150及50 IU/L)濃度的肝素鈉溶液,于664 nm處測(cè)定An值,12 h內(nèi)重復(fù)6次,考察供試品的穩(wěn)定性與精密度。各濃度溶液連續(xù)測(cè)定6次,考察重復(fù)性。

        1.2.5加樣回收率 精密稱(chēng)取空白制劑,配制肝素濃度分別為完全溶出時(shí)的80%、100%和120%的肝素溶液,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,精密量取續(xù)濾液,于664 nm處測(cè)定An值,計(jì)算回收率。

        1.2.6肝素脂質(zhì)體的制備 參考文獻(xiàn)[16-20]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定以卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(A因素)、卵磷脂與肝素的質(zhì)量比(B因素)及水化時(shí)間(C因素)為本次正交試驗(yàn)的3因素,各設(shè)立3個(gè)水平,A因素為4 ∶1、6 ∶1及8 ∶1,B因素為10 ∶1、15 ∶1及20 ∶1,C因素為1、1.5及2 h,并以包封率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn);初步條件摸索也考察了溫度、轉(zhuǎn)速及有機(jī)溶劑對(duì)包封率的影響。采用薄膜分散-超聲法制備脂質(zhì)體,根據(jù)處方按一定比例精密稱(chēng)取卵磷脂和膽固醇置于100 mL茄形瓶中,二氯甲烷10 mL溶解,水浴溫度25 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,至卵磷脂與膽固醇在茄形瓶?jī)?nèi)壁形成一層均勻的淡黃色薄膜,加PBS緩沖液(pH 7.4)溶解的肝素鈉溶液,50 ℃水浴震蕩至磷脂膜水化完全,超聲處理10 min,即得淡黃色肝素脂質(zhì)體。

        1.2.7溫敏水凝膠的制備 精密稱(chēng)取一定量CS和β-GP,分別溶于0.1 mol/L冰醋酸溶液和純水中,配制成1.5%、1.8%、2.0%及2.2%的CS溶液和45%、50%、56%及60%的β-GP溶液。冰水浴條件下,邊攪拌邊向CS溶液中逐滴加β-GP溶液,得到一系列CS和β-GP質(zhì)量比不同的澄清溶液,置于(37±0.5)℃恒溫水浴鍋中,采用目視結(jié)合試管倒轉(zhuǎn)方法觀察凝膠狀態(tài)并記錄膠凝時(shí)間,同時(shí)根據(jù)CS與β-GP最佳質(zhì)量比配制含肝素溫敏水凝膠,并考察不同緩釋材料對(duì)溫敏水凝膠釋放性能的影響。

        1.2.8肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的制備 根據(jù)“1.2.6”項(xiàng)下正交試驗(yàn)確定肝素脂質(zhì)體最佳制備工藝制備一定量的脂質(zhì)體,常溫備用;根據(jù)“1.2.7”項(xiàng)下篩選出制備溫敏水凝膠的CS與β-GP最佳質(zhì)量比,取一定量的肝素脂質(zhì)體與2%CS溶液置于冰浴中,攪拌混合均勻,緩慢滴加56%β-GP溶液,用磁力攪拌器攪拌均勻,可制得肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠[21-22]。

        1.2.9體外釋放度測(cè)定 采用動(dòng)態(tài)透析袋法,對(duì)肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠進(jìn)行體外釋放度測(cè)定。將制劑放入預(yù)先處理的透析袋中,置于盛有25 mL PBS溶液(pH 7.4)的燒杯,溫度為(37±0.5)℃,振蕩轉(zhuǎn)速100 r/min,按時(shí)間點(diǎn)0.5、1、2、4、6、8、16、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336及360 h依次取樣,補(bǔ)充等溫等體積的同批次PBS溶液;以空白脂質(zhì)體CS/β-GP溫敏水凝膠為對(duì)照,于664 nm處用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定△A,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)釋放介質(zhì)中肝素的含量,根據(jù)累積釋放度公式F=Mt/M∞,Mt/M∞為t時(shí)間肝素累積釋放百分率(%),來(lái)求出各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度,繪制體外累積釋藥曲線。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 方法學(xué)考察

        2.1.1專(zhuān)屬性 結(jié)果顯示,亞甲基藍(lán)與肝素于664和575 nm處均有吸收,且664 nm處吸收最大,同時(shí)在此條件下空白制劑均無(wú)干擾。

        2.1.3穩(wěn)定性、精密度及重復(fù)性 室溫下,絡(luò)合反應(yīng)于0.5 h內(nèi)反應(yīng)完全,且此后的12 h穩(wěn)定,肝素高、中、低濃度的穩(wěn)定性RSD分別為1.2%、1.77%及1.09%,表明該方法穩(wěn)定性較好;日內(nèi)精密度RSD分別為1.56%、2.17%及1.16%,日間精密度RSD分別為2.08%、2.55%及1.48%,表示該方法精密度較良好;重復(fù)性考察的RSD分別為1.03%、0.45%及0.22%,表示該方法重復(fù)性好。

        2.1.4加樣回收率 肝素完全溶出80%、100%及120%的回收率分別為99.67%、100.79%及100.24%,RSD為0.56%,表明該方法回收率較好。

        2.2 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的制備及體外釋放度的測(cè)定

        2.2.1脂質(zhì)體的正交實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(表1和表2),最優(yōu)處方為A2B1C2,即卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6 ∶1,卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為10 ∶1,水化時(shí)間為1.5 h;方差分析結(jié)果顯示(表2),B因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且各因素對(duì)指標(biāo)影響大小次序?yàn)锽>C>A;處方工藝驗(yàn)證結(jié)果表明(表3),3批次脂質(zhì)體RSD為2.07%,各批次間差異小,工藝重現(xiàn)性良好,制備工藝穩(wěn)定、可靠。

        表1 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the L9(33)orthogonal design

        表2 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.2 Results of analysis of variance in the orthogonal test

        表3 各批脂質(zhì)體處方工藝驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Results of three batches of liposomes of prescription process verification

        2.2.2溫敏水凝膠的篩選 在一定條件下,CS與β-GP的質(zhì)量比減小,膠凝化過(guò)程縮短。制備好的溫敏水凝膠在低溫條件下,呈乳白、均勻、可流動(dòng)的液體狀(L);當(dāng)溫度接近正常生理體溫,發(fā)生膠凝化轉(zhuǎn)變,成膠后為乳白色不可流動(dòng)的半固體凝膠(S);凝膠化前可用1 mL醫(yī)用注射針頭順利吸取注射,成膠后不可注射。見(jiàn)表4。

        表4 CS與β-GP質(zhì)量比對(duì)溫敏水凝膠凝膠化時(shí)間的影響Tab.4 Effect of mass ratio of CS and β-GP on gelation time of CS/β-GP thermosensitive hydrogel

        2.2.3肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠體外釋藥動(dòng)力學(xué) 經(jīng)脂質(zhì)體與CS/β-GP雙重包載的Hep可注射脂質(zhì)體溫敏水凝膠對(duì)Hep釋放具有緩釋作用,Hep在pH 7.4的釋藥介質(zhì)中前0.5 h累積釋放量不足3%、沒(méi)有突釋現(xiàn)象,釋藥144 h的累積釋放量達(dá)到50%,說(shuō)明通過(guò)脂質(zhì)體與CS/β-GP溫敏水凝膠雙重包裹的肝素具有較好的緩釋作用;將優(yōu)化處方利用零級(jí)方程、一級(jí)方程、Higuchi模型及Ritger-Peppas模型進(jìn)行釋藥行為擬合,結(jié)果表明,一級(jí)方程擬合的r較大,說(shuō)明該方程能較好描述肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠的體外釋放性能,即釋藥特點(diǎn)是按時(shí)間變化先多后少的非恒速釋藥;同時(shí)肝素溫敏水凝膠的釋藥特性用Ritger-Peppas模型擬合亦較佳,且釋藥指數(shù)為0.529 2,藥物釋藥機(jī)制為擴(kuò)散和溶蝕協(xié)同作用,主要為擴(kuò)散作用。見(jiàn)圖1和表5。

        圖1 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠釋藥曲線Fig.1 Cumulative release curves of Hep from liposomes CS/β-GP thermosensitive hydrogels

        表5 肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠中肝素釋藥模型擬合結(jié)果Tab.5 Hep liposomes thermosensitive hydrogels in vitro released in various models

        3 討論

        臨床上一般采用皮下注射肝素來(lái)治療DVT,能極大降低致死率[23]。但肝素半衰期短,緩釋效果不夠理想,藥效作用時(shí)間短,需連續(xù)多次注射才能有較好的治療效果,導(dǎo)致病人的順應(yīng)性較差,且皮下注射易出現(xiàn)出血癥狀[8]。理想的肝素制劑應(yīng)具備良好的生物相容性、可降解性、藥物緩釋及方便操作等性能,針對(duì)這一需求,本研究分析了一種緩釋制劑,將肝素制成脂質(zhì)體溫敏水凝膠,使藥物具有靶向性,控制藥物釋放速度,維持血藥濃度穩(wěn)定,增長(zhǎng)藥效作用時(shí)間,減少藥物毒副作用,提高患者的依從性。

        由于肝素是一種蛋白多糖,在紫外-可見(jiàn)區(qū)無(wú)紫外吸收[24],所以本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)比色法來(lái)間接測(cè)定肝素的濃度,利用肝素與亞甲基藍(lán)在一定濃度范圍內(nèi)的褪色反應(yīng),建立紫外可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行方法學(xué)考察;考察亞甲基藍(lán)的濃度與肝素最大吸收波長(zhǎng),最終確定控制肝素于664 nm處有最大吸收峰,亞甲基藍(lán)的濃度為0.024 g/L。

        本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散-超聲法[25-26]制備肝素脂質(zhì)體,選用動(dòng)態(tài)透析袋法進(jìn)行體外釋放度測(cè)定。通過(guò)前期三因素三水平正交實(shí)驗(yàn),最終確定了卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為6 ∶1,卵磷脂與藥物的質(zhì)量比為10 ∶1,水化時(shí)間為1.5 h為最優(yōu)處方,制備的脂質(zhì)體具有最優(yōu)的釋藥效能,其釋藥特性用Higuchi模型和Ritger-Peppas模型擬合較好。在制備肝素脂質(zhì)體時(shí),初步確定條件,考察溫度(30、40、50及60 ℃)的影響,當(dāng)溫度較低時(shí),肝素溶液不易將薄膜洗脫下來(lái);溫度過(guò)高則影響其磷脂化,造成水化不完全,包封率較低,最終采用溫度為50 ℃。對(duì)離心轉(zhuǎn)速(2 000、4 000、6 000、8 000、1 000及12 000 r/min)進(jìn)行了考察,轉(zhuǎn)速較小,脂質(zhì)體并不能有效分離,會(huì)造成包封率偏??;轉(zhuǎn)速過(guò)大,直接將以包裹的脂質(zhì)體破壞,造成藥物泄漏,包封率減小,較為嚴(yán)重的情況為達(dá)不到緩釋作用,最終確定轉(zhuǎn)速為8 000 r/min。卵磷脂與膽固醇的溶解采用有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)考察了三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇及無(wú)水乙醇等,最后采用毒性較小且溶解效果較好的二氯甲烷溶解。

        在制備溫敏水凝膠時(shí),隨著CS與β-GP的質(zhì)量比減小,膠凝化過(guò)程縮短,這可能是β-GP為強(qiáng)堿弱酸鹽,增大β-GP的量,該體系中pH值增大,由冰醋酸溶解的CS顯酸性,使在體系中CS與β-GP結(jié)合的量增大,CS/β-GP間的靜電引力作用增強(qiáng),從而使在生理狀態(tài)下,膠凝化過(guò)程縮短[22]。最終確定2%CS與56%β-GP為制備溫敏水凝膠的最佳質(zhì)量比。采用動(dòng)態(tài)透析袋法進(jìn)行體外釋放度測(cè)定,其釋藥特性用一級(jí)方程、Higuchi模型和Ritger-Peppas模型擬合較好,藥物釋藥機(jī)制按時(shí)間變化先多后少的非恒速釋藥,同時(shí)伴隨擴(kuò)散和溶蝕,主要為擴(kuò)散作用。在制備溫敏水凝膠的時(shí)候,考察了泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、海藻酸鈉及卡波姆940等緩釋材料,考慮到溫敏水凝膠的特殊性能,能隨環(huán)境溫度的改變而發(fā)生變化,最終選用殼聚糖作為凝膠載體。天然無(wú)毒可降解載體材料殼聚糖制備肝素溫敏水凝膠,加入β-GP對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,常溫下具有可注射性,生理狀態(tài)下化為半固體,可實(shí)現(xiàn)局部定位緩慢釋放,發(fā)揮靶向制劑的作用,可維持血藥濃度,減少給藥劑量和次數(shù),降低不良反應(yīng)[27]。

        通過(guò)將脂質(zhì)體與殼聚糖兩者的優(yōu)勢(shì)結(jié)合所制備的肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠,其體外釋藥特性用一級(jí)方程和Ritger-Peppas模型擬合較好,其釋藥特點(diǎn)按時(shí)間變化先多后少,其過(guò)程伴隨著溶蝕和擴(kuò)散,以擴(kuò)散作用為主。

        綜上所述,本研究所制備肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠,結(jié)合脂質(zhì)體與水凝膠的優(yōu)勢(shì),將其釋放性能更好地表現(xiàn),為進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ),同時(shí)也為研究局部注射用肝素脂質(zhì)體溫敏水凝膠提供科學(xué)依據(jù)。

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