孫佳，潘潔，秦蘭,，楊淑婷,，劉春花，徐興蓮，王永林，陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025)

葒草為蓼科植物葒草(PolygonumorientaleL.)的干燥果穗及帶葉莖枝，性平、味辛，歸肝脾經，具有祛風除濕和活血消腫的功效，用于治療風濕性關節(jié)炎、冠心病、疝氣及瘡腫等，收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》中，葒草在貴州省分布廣泛，為民間常用于緩解胸痛、胸悶及氣短等急性心肌缺血癥狀的治療[1-3]。國內外研究報道表明，葒草藥材中含有黃酮類、木質素類、甾體皂苷類及二苯乙烯類等化學成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗心肌缺血和抗缺氧、增加心肌營養(yǎng)血流量、保護梗死心肌、抗血栓、抗氧化及抗菌等多種藥理活性[4-7]。本課題組前期已開展葒草藥用部位的篩選和化學成分研究，確定了葒草的有效部位為水煮醇沉、正丁醇萃取80%乙醇洗脫段，其含量較高的主要活性成分為黃酮類化合物，如葒草素、異葒草素及牡荊素等[8-9]，并明確了其在細胞水平上對體外H9C2細胞有抗氧化作用[10]。心肌缺血(myocardial Ischemia，MI)是指冠狀動脈的供血不能滿足心肌耗氧量的需求，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常的一種病理綜合征[11-13]。缺血性心臟病或突發(fā)性心臟病是世界范圍內最常見的致死和致殘的單一因素，MI為冠心病、心絞痛及心肌梗死等多種疾病的共同病理生理機制[14-17]。研究表明，大劑量異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO) 可因增加心肌耗氧而造成大鼠急性MI，其主要機制是通過強烈收縮冠狀動脈，造成心肌組織急性供血不足，并能增加外周阻力和心臟負荷，其心電圖、心肌酶學及組織病理學變化均類似于人類MI致急性心肌梗死的病變特征[18-20]。因此本研究選擇ISO誘導的大鼠急性MI為模型，通過觀察不同時間葒草提取物對急性MI大鼠的心電圖、血清酶學指標及心肌組織形態(tài)學的影響，探討葒草對MI損傷的作用、藥物起效時間及其作用機制，為葒草產品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級Sprague Dawley (SD)大鼠30只，雄性，體質量為(250±20)g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供[動物許可證號SCXK(渝)2012-0008]。

1.1.2主要藥品與試劑 葒草藥材購買自貴州省六盤水，由貴州醫(yī)科大學劉春花副教授鑒定為蓼科植物葒草的干燥全草，標本存于貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，葒草提取物由該室提取制備。復方丹參片(廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號G17A007)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及磷酸肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鹽酸ISO(上海禾豐制藥有限公司，批號100203)，水合氯醛(純度≥0.99，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.1.3主要儀器 四通道生物信號采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，680型酶標儀(上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)，Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter公司)；超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，微量移液器(德國Eppendorf股份公司)，超低溫冰箱和MD-100自動生化分析儀(美國 Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1動物造模和分組 30只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機均分為正常組、模型組、陽性藥復方丹參片對照組(1 g/kg，陽性對照組)、葒草提取物低劑量組(3.2 g/kg，葒草低劑量組)及葒草提取物高劑量組(6.4 g/kg，葒草高劑量組)；除正常組外，其他各組大鼠分別以50 mg/kg劑量皮下注射ISO生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射2 d制備急性MI大鼠模型；正常組大鼠注射等體積的生理鹽水。造模完成后，葒草低、高劑量組和陽性對照組均給予相應治療藥物灌胃，2次/d，連續(xù)3 d；模型組和空白對照組大鼠灌胃等體積蒸餾水(15 mL/kg)。

1.2.2心肌電生理指標測定 各組大鼠末次給藥后，腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)，用針狀電極插入左下肢、左上肢和右上肢連續(xù)監(jiān)測標準Ⅱ導聯(lián)心電圖，進行心電監(jiān)護，觀察給藥后0.5、2.0及6.0 h時各組大鼠的心電圖(electrocardiogram，ECG)變化，測量ST段的偏移程度。

1.2.3血清酶學指標 各組大鼠于末次給藥后0.5、2.0及6.0 h，經尾靜脈取血約1 mL置塑料離心管中，4 ℃靜置2 h，4 ℃、3 000 r/ min離心 10 min，吸取上層血清，按照相關試劑盒說明書操作，用MD-100自動生化分析儀檢測血清中LDH、SOD及CK-MB水平。

1.2.4組織形態(tài)學指標 各組大鼠于末次取血結束后，取出心臟、洗凈血液、立即放入含20倍組織體積的4%多聚甲醛溶液中固定，16～24 h后脫水、包埋及制作5 μm石蠟切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學改變。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 ECG ST段的變化

與正常組相比，MI模型組大鼠ECG ST段明顯抬高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠ECG ST段均降低(P<0.05或P<0.01)；陽性對照組的大鼠ECG ST段與模型組相比，亦明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠ECG 不同時點ST段變化Tab.1 Changes of ST segment in ECG of rats in each group at different time points

2.2 血清SOD

與正常組相比，模型組大鼠血清SOD水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清SOD水平升高(P<0.05)，但給藥后各時間點血清SOD水平升高程度無差異(P>0.05)；陽性對照組的大鼠血清SOD水平與模型組相比亦升高(P<0.01)，且給藥后各時間點血清SOD水平也無差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時點血清SOD水平Tab.2 Changes of SOD content in serum of rats in each group at different time points

2.3 血清LDH

與正常組相比，模型組大鼠血清LDH明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清LDH明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且給藥后2.0 h血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；陽性對照組的大鼠血清中LDH水平與模型組相比亦明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且給藥后2 .0 h的血清LDH水平低于0.5和6.0 h的血清LDH水平，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各時間點LDH降低程度與葒草提取物各組較一致。見表3。

表3 各組大鼠不同時點血清LDH水平Tab.3 Changes of LDH content in serum of rats in different groups at different time points

2.4 血清CK-MB

與正常組相比，模型組大鼠血清CK-MB明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，葒草低、高劑量組大鼠血清中CK-MB降低(P<0.05)，且降低程度隨時間的增加而減??；陽性藥對照組的大鼠血清中CK-MB與模型組相比亦降低(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠不同時點血清CK-MB水平Tab.4 Changes of CK-MB content in serum of rats in different groups at different time points

2.5 心肌組織組織學

正常組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，胞質，胞核清晰，肌纖維排列整齊有序。模型組大鼠心肌細胞出現(xiàn)變性壞死和出血，肌纖維排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞輕度增生及血管增生充血。用藥各組大鼠心肌細胞病變較模型組減輕，其中陽性對照組組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，細胞間隙水腫減輕，成纖維細胞增多間質內偶見部分炎性細胞浸潤；葒草低劑量組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，肌束間隔略增寬，細胞間隙水腫減輕，間質內偶見部分炎性細胞浸潤及灶性心肌出血；葒草高劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，輕中度空泡樣變性，肌束間隔中度增寬，輕度水腫，間質少量炎性細胞浸潤及灶性心肌變性和出血。見圖1。

正常組 模型組 陽性對照組 葒草低劑量組 葒草高劑量組圖1 各組大鼠心肌組織的病理形態(tài)學特征(HE，×100)Fig.1 The pathomorphological characteristics of myocardial tissues of rats in each group(HE，×100)

3 討論

本研究采用ISO皮下注射的方法誘導大鼠急性MI，異丙腎上腺素是經典的β1、β2受體激動藥，其能夠興奮心臟的β1受體，能夠通過收縮冠狀動脈、使心率加快及傳導加速，從而妨礙冠狀動脈血灌注流量造成心肌耗氧量增加，心臟負荷過重，心肌微循環(huán)障礙，冠狀動脈痙攣，心肌梗死樣變，引起MI[21-22]。ECG 是缺血心肌變化的敏感指標，當大鼠心肌產生心肌損傷及壞死時，會出現(xiàn)ECG ST段的異常改變，所以MIST段的變化幅度可基本反映MI的嚴重程度，因此ST段的偏移可作為缺血程度的定量指標[23]。本實驗結果可見，葒草提取物組可顯著降低由于急性MI所致的大鼠ECG ST段的抬高，且效果隨著給藥后時間的增加而增大，說明葒草提取物可有效改善大鼠MI后導致的ECG 異常改變，且作用效果較強且持久。

當MI產生時，細胞膜通透性增加，細胞內酶大量釋放入血液，而血清中心肌酶CK-MB、LDH等的高低可反映缺血心肌的損傷程度[24]，其中 CK-MB是磷酸肌酸激酶CK的4種同工酶之一，95%的CK-MB存在于心肌細胞質中，能催化肌酸和腺苷三磷酸生成磷酸肌酸和腺苷二磷酸，該可逆性反應所產生的磷酸肌酸含高能鍵，是肌肉收縮能量的直接來源[25-26]；CK-MB釋放數(shù)量的變化與心肌損傷程度呈正相關，是反映心肌損傷最敏感的指標之一[27]。LDH 是糖酵解途徑中的重要酶，位于細胞質，廣泛分布于各組織中，心肌居第2位[28-29]。當MI、心肌細胞損傷及細胞膜破壞時，即使少量心肌組織損傷或壞死所釋放的酶，都足以引起血清中該酶活性的升高[17]，故其活性是反映MI損傷的重要指標之一。當MI缺氧時，由于產生大量的過氧化物，導致SOD大量消耗，使其活力降低，所以通過檢測SOD活性可以評估組織內自由基代謝情況及MI程度[30]。

本研究結果顯示，與模型組相比，葒草提取物降低了MI所致的ECG ST段抬高，減少了CK-MB和LDH的釋放，提高了血清SOD活性，因此提示對急性MI具有明顯的保護作用，其作用機制可能與保護心肌細胞功能、提高心肌抗氧化能力、清除氧自由基有關。通過觀察不同時間點的藥效結果，可見模型大鼠給藥0.5 h就有顯著的治療效果，說明葒草提取物具有起效迅速的優(yōu)點。同時，研究顯示大鼠血清中SOD活性和CK-MB隨著時間延長而逐漸升高、LDH先降低后升高，產生該現(xiàn)象的原因可能與上述藥效指標相關的化合物在體內的吸收、分布、代謝和排泄(absorption,distribution,metabolism and excretion，ADME)過程改變有關。從劑量上看，低劑量組大鼠藥效比高劑量組更好，高劑量組心肌組織病理切片可見組織空泡化，可能是因為高劑量組的葒草提取物用量超過了它本身正常的量效關系。

綜上所述，通過ISO致急性MI模型，大鼠出現(xiàn)典型的MI現(xiàn)象，同時血液中LDH和CK-MB升高，SOD降低，表示造模成功；而葒草提取物低、高劑量組均能改善MI的狀態(tài)，藥效實驗數(shù)據(jù)顯示，低劑量組藥效最好，本研究初步闡明了葒草提取物對MI損傷具有保護作用。