陳立杰， 方遠(yuǎn)鵬， 杜巧麗， 陳 俊， 蔣君梅， 陳美晴， 李向陽， 謝 鑫

(1.貴州大學(xué)資產(chǎn)經(jīng)營辦公室， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025)

水稻(Oryzasativa)是世界五大糧食作物之一，主要分為秈稻和粳稻或糯稻，是中國及部分國家的主糧。隨著水稻基因組組裝的完成，對水稻基因水平研究已成為熱點(diǎn)[1]，其中蛋白翻譯后修飾過程也成為研究的焦點(diǎn)之一[2-4]。

泛素化是一類小分子蛋白，在酶(泛素激活酶[5]、結(jié)合酶[6]及連接酶[7])的調(diào)控下，能對靶標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性修飾[8]，同時(shí)泛素化在蛋白質(zhì)功能體現(xiàn)[9]及降解[10-11]過程中具重要作用；泛素化還間接參與細(xì)胞凋亡[12]、植物免疫反應(yīng)[13]、營養(yǎng)運(yùn)輸[14]、水分抗性[15]、損傷修復(fù)[16]等各種生命活動。而去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)則可以逆轉(zhuǎn)泛素化過程，輔助調(diào)節(jié)生命活動；其主要包括UBP/USP(泛素特異性蛋白酶)家族﹑UCH(泛素C末端水解酶)家族﹑OTU(卵巢腫瘤蛋白酶)家族、MJD(MachadoJoseph域)家族和JAMM(JAB 1/MPN/MOV 34蛋白酶)家族[17]。研究報(bào)道去泛素化酶在抗病響應(yīng)[18]、細(xì)胞增殖[19]、植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控[20]等多個(gè)方面起著重要的調(diào)節(jié)作用。

泛素C端水解酶(ubiquitin carrboxy terminal hydrolases，UCHs)在蛋白質(zhì)的降解過程中具有反向調(diào)控作用，可促進(jìn)泛素的再循環(huán)。研究報(bào)道，UCHs可通過去泛素化的作用對細(xì)胞周期產(chǎn)生影響，并且在代謝調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及DNA修復(fù)等過程中具有關(guān)鍵作用[20]。UCH- L 5(UCH 37)被作為DUBs中泛素C末端水解酶(UCH)家族的半胱氨酸蛋白酶，主要由蛋白酶體和INO 80染色質(zhì)復(fù)合體組成[21]。據(jù)報(bào)道，在癌細(xì)胞中對UCH-L5基因進(jìn)行過表達(dá)或進(jìn)行基因敲除，可使小鼠在胚胎期致死[22-23]；同時(shí)該基因可能參與調(diào)節(jié)生物體的壽命[24]。而在植物擬南芥中，AtUCH4突變體能產(chǎn)生較野生型更耐強(qiáng)鹽、脫落酸(ABA, abscisic acid)的抗性[20]；AtUCH4同時(shí)更能抵抗低溫逆境，并與AtPTP1基因形成負(fù)相關(guān)的基因?qū)25]。擬南芥中過量表達(dá)AtUCH1基因時(shí)，對生長素信號通路具有一定促進(jìn)作用(如促使生長素不敏感型突變體恢復(fù)正常[26])。此外，去泛素化酶UCH-L 3與K 27鏈接類型二泛素(K 27 diub)互作可促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)[27-28]。

近年來關(guān)于植物UCH家族的研究主要集中在UCH-L 3和UCH 4，對UCH-L 5在植物中的研究報(bào)道較少，本研究對水稻OsUCH-L5基因的序列特征以及表達(dá)模式進(jìn)行探究，以期為OsUCH-L5的泛素化模型研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材 料

水稻材料日本晴(OryzaSativaL. spp.japonica)品種保存于貴州大學(xué)植物病理教研室。

1.1.2試 劑

本實(shí)驗(yàn)中所用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，SYBR熒光染料購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。所用的激素，鹽脅迫和其它脅迫處理劑均購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用MEGA 7.0軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)(bootstrap=1000)方式構(gòu)建無根進(jìn)化樹，并于EvolView美化。采用HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)聯(lián)合SMART獲得OsUCH-L 5蛋白的保守域；使用EXPASy軟件完成OsUCH-L 5蛋白的理化性質(zhì)測定與親水性分析；OsUCH-L 5蛋白的二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位在PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和Softberry(http://www.softberry.com)分別進(jìn)行預(yù)測。并基于SWISS-MIDEL網(wǎng)站直接預(yù)測SWISS-MODEL及PyMOL單模型構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。

1.3 OsUCH-L5基因克隆與重組載體的構(gòu)建

1.3.1總RNA的提取與cDNA的反轉(zhuǎn)錄

取水稻日本晴三葉期植株，利用RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別完成水稻RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄，所獲cDNA于-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.3.2OsUCH-L5基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中水稻染色體注釋信息直接獲得了水稻OsUCH-L5(NCBI編號：LOC 4331185)，依據(jù)提供的CDS序列及已獲的cDNA模板，設(shè)計(jì)引物(表1)并擴(kuò)增OsUCH-L5基因，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到中間載體pEASY上。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 UCH-L5基因的表達(dá)情況分析

1.4.1UCH-L5基因的非生物逆境表達(dá)特征

取水稻種子滅菌消毒后，種植于滅菌營養(yǎng)土中，待水稻長到三葉期時(shí)，取水稻根、莖、葉組織，提取RNA用并反轉(zhuǎn)錄cDNA后，用特異性引物(表1)進(jìn)行RT-qPCR(quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)檢測。處理組的材料選取長勢一致的植株，通過4 ℃低溫和40 ℃高溫處理，并利用脫落酸(ABA，200 μmol·L-1)、D-甘露醇(D-mannitol，1 mmol·L-1)、氯化鈉(NaCl，250 mmol·L-1)、油菜素內(nèi)酯(BR，200 μmol·L-1)分別進(jìn)行干旱、鹽脅迫及激素處理。最后分別在0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h取樣，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理5株苗，并將樣本-80 ℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2數(shù)據(jù)整理與分析

RT-qPCR結(jié)果以2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析，并利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻去泛素化酶編碼基因OsUCH-L5的克隆

用OsUCH-L5-F/OsUCH-L5-R引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增經(jīng)水稻總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，得到目的基因大小為837 bp，其編碼278個(gè)氨基酸。經(jīng)測序以及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)條帶大小與數(shù)據(jù)庫預(yù)測大小一致(圖1)。

2.2 OsUCH-L 5蛋白的序列分析

2.2.1OsUCH-L 5蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測及亞細(xì)胞定位

利用ProtComp軟件對OsUCH-L 5蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，預(yù)測該蛋白定位于細(xì)胞核，符合該類亞家族的特點(diǎn)。Prot-param軟件預(yù)測OsUCH-L 5蛋白理化性質(zhì)結(jié)果顯示，其相對分子質(zhì)量31.644 08 kD，等電點(diǎn)為5.66，氨基酸共278個(gè)，且谷氨酸(Glu)含量最多，達(dá)到10.4%。負(fù)電荷及正電荷殘基分別為43個(gè)和39個(gè)，脂肪指數(shù)為82.16，不穩(wěn)定指數(shù)為48.88，該蛋白較不穩(wěn)定，具強(qiáng)親水性(表2)。

表2 OsUCH-L 5蛋白的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physical and chemical parameters of OsUCH-L 5 protein

2.2.2OsUCH-L 5蛋白的序列分析

根據(jù)MEGA 7以鄰接法完成系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，并結(jié)合SMART及HMMER對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，SMART結(jié)果顯示，OsUCH-L 5蛋白2-153及163-220處具一個(gè)Peptidase_C 12結(jié)構(gòu)域和一個(gè)卷曲區(qū)域。且所有的UCH-L 5蛋白均具備一個(gè)Ⅰ亞族結(jié)構(gòu)的Peptidase_C 12保守域及一段UCH_C的UCH家族識別保守域。水稻OsUCH-L 5和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdUCH-L 5親緣關(guān)系最近，且同科內(nèi)蛋白在系統(tǒng)進(jìn)化樹上聚合為一支(圖2)。

2.2.3水稻OsUCH-L 5蛋白結(jié)構(gòu)及親水性分析

利用ProtScale網(wǎng)站獲得OsUCH-L 5蛋白(圖3 A)親水性情況，結(jié)果表明，其親水性上下限為1.756和-3.000，疏水區(qū)主要在20～40 aa、105～115 aa、124～130 aa、162～168 aa、205～219 aa、242～250 aa，顯示OsUCH-L 5蛋白具有強(qiáng)親水性。通過SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，顯示OsUCH-L 5蛋白主要由螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖3 B)。

2.3 OsUCH-L5基因表達(dá)分析

2.3.1OsUCH-L5基因的組織表達(dá)分析

以水稻Ubiquitin為內(nèi)參基因，分析OsUCH-L5在不同組織的表達(dá)模式。qRT-PCR結(jié)果表明，水稻OsUCH-L5基因在根、莖、葉不同組織均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，即根>葉>莖(圖4 A)。

2.3.2OsUCH-L5基因在NaCl及模擬干旱脅迫下的應(yīng)答分析

為闡明干旱和鹽分脅迫中OsUCH-L5基因的作用，通過RT-qPCR檢測NaCl、ABA、D-mannitol處理下OsUCH-L5基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在鹽處理下，OsUCH-L5基因表達(dá)在極短時(shí)間內(nèi)顯著降低，但在處理6 h之后，OsUCH-L5基因表達(dá)量顯著上升，并在12 h達(dá)到最大值(圖4 B)。利用ABA和D-mannitol模擬干旱脅迫，結(jié)果顯示，OsUCH-L5基因在ABA處理6 h時(shí)基因表達(dá)量顯著增加至峰值，之后顯著下降(圖4 C)。而在D-mannitol處理下，OsUCH-L5基因在0.5 h顯著上升達(dá)到最大值，之后又出現(xiàn)下調(diào)(圖4 D)。

2.3.3OsUCH-L5基因在BR下的應(yīng)答分析

為探究BR對OsUCH-L5基因表達(dá)影響，采用RT-qPCR進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，OsUCH-L5基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降模式，于3 h達(dá)到峰值。在6 h后OsUCH-L5基因表達(dá)量與對照相同(圖5 A)。

2.3.4OsUCH-L5基因溫度脅迫分析

為探索OsUCH-L5基因是否受到溫度脅迫的影響，分別在4 ℃低溫和40 ℃高溫脅迫處理后，對其進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示，OsUCH-L5基因在低溫及高溫處理下，均在0.5 h時(shí)基因表達(dá)量顯著降低，但在連續(xù)低溫(圖5 B)及高溫(圖5 C)處理下，分別在3 h和1 h時(shí)，基因表達(dá)量顯著增加至峰值，隨后又逐漸降低。說明OsUCH-L5基因能迅速響應(yīng)溫度脅迫信號(圖5 C)。

3 討 論

泛素化調(diào)節(jié)被作為生物體內(nèi)必不可少的可逆性調(diào)節(jié)途徑，在生物體生長發(fā)育過程中具有重要意義，其可逆過程主要由泛素化酶的修飾[29]及去泛素化酶[30]的修飾完成。去泛素化酶同時(shí)還參與生物器官發(fā)育[26,31]、細(xì)胞分化[32]等過程，其廣泛參與到對動物腫瘤[33]、植物免疫抗性[34-37]以及病原物的致病性等方面[38-39]。

UCH家族作為去泛素化酶重要的一員，其翻譯產(chǎn)物能協(xié)調(diào)多種蛋白質(zhì)共同完成對生物或非生物應(yīng)激的反應(yīng)，劉石娟[25]的研究表明，AtUCH4/AtPTP1基因的表達(dá)與鹽脅迫相關(guān)，具有正調(diào)控作用。張靜進(jìn)一步對AtUCH4基因在各種非生物逆境下的反應(yīng)進(jìn)行研究，更進(jìn)一步明確了AtUCH4基因在組織表達(dá)的選擇性以及受到ABA的正調(diào)控[20]。

本研究中OsUCH-L5基因的表達(dá)具有組織特異性，在根中表達(dá)量最高，而在葉和莖中表達(dá)較弱；這與擬南芥中AtUCH4基因在根中選擇性表達(dá)具有相似性[25]。張靜[20]的研究表明，AtUCH4基因的表達(dá)受到鹽脅迫以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)。這與本研究中OsUCH-L5基因表達(dá)結(jié)果一致，在模擬干旱(ABA，D-manntiol)和鹽脅迫(NaCl)處理下，OsUCH-L5基因表達(dá)量也上調(diào)表達(dá)。

油菜素內(nèi)酯是植物重要的生長調(diào)節(jié)劑和藥害解除劑，可促進(jìn)植物對多種逆境反應(yīng)進(jìn)行適應(yīng)[40]。本研究發(fā)現(xiàn)OsUCH-L5基因在油菜素內(nèi)酯的處理下，OsUCH-L5基因受到誘導(dǎo)表達(dá)，這一結(jié)果與ABA或NaCl處理結(jié)果相似，因此，推測OsUCH-L5基因參與多種脅迫信號反應(yīng)；同時(shí)在4 ℃或40 ℃脅迫處理下，OsUCH-L5均受到誘導(dǎo)表達(dá)，均在3 h時(shí)表達(dá)水平最高；劉石娟等[25]的研究提出，UCH基因可能與溫度響應(yīng)有關(guān)，主要受到溫度的負(fù)調(diào)控，這與本研究中水稻OsUCH-L5基因受溫度誘導(dǎo)表達(dá)不同，可能是由于溫度持續(xù)脅迫時(shí)間不同所導(dǎo)致的。

4 結(jié) 論

本研究克隆了水稻OsUCH-L5基因，全長837 bp，編碼278個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白具有Peptidase_C 12和UCH_C結(jié)構(gòu)域，相對分子質(zhì)量為31.64 kDa，等電點(diǎn)為5.66，與二穗短柄草BdUCH-L 5親緣關(guān)系最近。OsUCH-L5基因具組織特異性，在根部表達(dá)最佳；此外，OsUCH-L5基因分別參與對鹽、干旱、激素以及溫度脅迫的反應(yīng)。該研究為進(jìn)一步研究水稻OsUCH-L5基因功能提供基礎(chǔ)。