嚴(yán)琳玲， 虞道耿， 郇恒福， 王文強(qiáng)

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 儋州 571737)

土壤鹽堿化不僅影響生態(tài)環(huán)境，還會使植物的形態(tài)外觀發(fā)生改變，并導(dǎo)致植物體內(nèi)的生理生化發(fā)生紊亂，從而造成減產(chǎn)或發(fā)生病蟲害[1]。我國鹽堿地面積9 000萬hm2[2]，且面積還在不斷增加[3]。雖然可通過一些工程措施或者化學(xué)措施對鹽堿地進(jìn)行改良，但成本較高且效果不明顯，容易復(fù)發(fā)[4]。因此，選育耐鹽品種將成為鹽堿地改良和利用的一項(xiàng)重要舉措[5]。

山螞蝗屬(DesmodiumDesv.)植物是熱帶及亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草之一[6]，主產(chǎn)于我國海南、云南及廣東等熱帶亞熱帶地區(qū)。山螞蝗鮮草產(chǎn)量較高，且營養(yǎng)價(jià)值豐富，常被用作青飼喂養(yǎng)鴨、鵝等家禽及牛、羊等牲畜[7]；由于其耐鹽、耐干旱，可與惡性雜草共存，因此也被用作綠肥間作幼齡果園及膠園[8]。此外，山螞蝗植物還含有一些黃酮類物質(zhì)及生物堿類物質(zhì)，具清熱利濕、消炎止痛等功效，也常被作為藥物提取[9]。

由于植物在不同的生長發(fā)育時(shí)期對逆境的敏感性都不一樣，而芽期和苗期是植物在生長發(fā)育過程中對鹽脅迫等逆境反應(yīng)較為敏感的時(shí)期[10]。因此，本試驗(yàn)對6份山螞蝗屬種質(zhì)芽期和苗期的耐鹽性進(jìn)行探討，以期篩選出芽期及苗期耐鹽種質(zhì)，進(jìn)而為培育耐鹽山螞蝗新品種提供理論依據(jù)。

1 材 料

6份山螞蝗均取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草備份庫，名稱及來源詳見表1。

表1 供試種質(zhì)材料來源Table 1 Sources of tested germplasms

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 山螞蝗屬種質(zhì)芽期耐鹽性研究

挑選大小一致、無蟲眼的山螞蝗屬種子，均勻地放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒，分別加入10 mL濃度為0、3、6、9 g·L-1的NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，以無離子水培養(yǎng)作對照，設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，溫度為25 ℃恒溫，每天光照12 h，光照強(qiáng)度2 500 lx。第8天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，以芽長超過種子長度的1/2，且根長等于種子長度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 山螞蝗屬種質(zhì)苗期耐鹽性研究

試驗(yàn)采用沙培盆栽。河砂在使用前先用清水沖洗，再用高錳酸鉀消毒，清洗，烘干備用。在花盆中撒入足量種子，待苗長至20 cm時(shí)進(jìn)行間苗，每盆留5株生長一致的健康苗。定時(shí)定量往花盆中澆入濃度為0、3、6、9 g·L-1的NaCl溶液，3次重復(fù)。

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.3.1山螞蝗芽期鹽脅迫測定指標(biāo)

采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)公式用單因素方差分析法分析同一鹽濃度下不同材料間及同一材料不同濃度間相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長、胚根長以及苗重的差異，并計(jì)算同一鹽濃度下不同材料間各指標(biāo)變異系數(shù)。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽總數(shù)/參試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(第3天發(fā)芽種子粒數(shù)/參試種子總粒數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(DG/DT)，式中，DG為逐日發(fā)芽數(shù)，DT為相應(yīng)DG的發(fā)芽天數(shù)；

耐鹽濃度(%)=發(fā)芽率達(dá)對照發(fā)芽率75%時(shí)相對應(yīng)的鹽濃度；

鹽極限濃度(%)=發(fā)芽率達(dá)對照發(fā)芽率10%時(shí)相對應(yīng)的鹽濃度；

耐鹽半致死濃度(%)=發(fā)芽率達(dá)對照發(fā)芽率50%時(shí)相對應(yīng)的鹽濃度；

某一指標(biāo)性狀相對值=鹽脅迫下性狀測定值/對照性狀測定值。

2.3.2山螞蝗苗期脅迫測定指標(biāo)

鹽脅迫15 d時(shí)測定生理指標(biāo)，其中葉綠素含量用乙醇提取比色法測定，采用電導(dǎo)法測定質(zhì)膜相對透性，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定；22 d時(shí)測定生物學(xué)指標(biāo)，測量5株幼苗自然高度。

2.3.3耐鹽性綜合評價(jià)

利用模糊數(shù)學(xué)中求隸屬函數(shù)的方法進(jìn)行各指標(biāo)抗鹽性綜合評價(jià)，其公式為

A：U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

B：1-(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，j=1，2，3，…，n；式中，j表示第j個(gè)指標(biāo)值，Xj表示性狀指標(biāo)的測定值，Xmin、Xmax分別為6個(gè)供試材料某一性狀指標(biāo)的最小值和最大值，如果抗性指標(biāo)測定值與抗性呈正相關(guān)，用A式，反之則用B式。

先求出各個(gè)抗鹽指標(biāo)在不同鹽濃度下的隸屬函數(shù)值，再將每一指標(biāo)在不同鹽濃度下的隸屬函數(shù)值累加求平均值，最后再將各品種不同抗鹽指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加求平均值，其平均值即為綜合評價(jià)值D，D值越大則說明其抗鹽性越強(qiáng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 鹽脅迫對山螞蝗種質(zhì)芽期生長的影響

3.1.1鹽脅迫對山螞蝗種質(zhì)相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢的影響

由圖1、圖2可看出，隨著鹽濃度的升高，6份山螞蝗種質(zhì)的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢均呈明顯下降趨勢(p<0.05)，且與對照相比，鹽脅迫后其相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢分別降低2.14%～100%、13.465%～100%，并且鹽脅迫濃度越高其降低幅度越大，但各材料對鹽脅迫的表現(xiàn)并不一致。在3 g·L-1NaCl濃度下，假地豆、異葉山螞蝗、糙伏山螞蝗、卵葉山螞蝗的相對發(fā)芽率均高于100%，異葉山螞蝗和卵葉山螞蝗的相對發(fā)芽勢高于100%，說明低鹽濃度，對部分山螞蝗種質(zhì)的發(fā)芽有促進(jìn)作用，且假地豆、異葉山螞蝗、顯脈山螞蝗、卵葉山螞蝗的相對發(fā)芽率均顯著高于長波葉山螞蝗。在6 g·L-1NaCl濃度下，假地豆和異葉山螞蝗表現(xiàn)較優(yōu)，相對發(fā)芽率極顯著高于長波葉山螞蝗和卵葉山螞蝗，相對發(fā)芽勢極顯著高于顯脈山螞蝗和長波葉山螞蝗；在9 g·L-1NaCl濃度下，假地豆的相對發(fā)芽率最高，達(dá)72.50%，極顯著高于異葉山螞蝗、糙伏山螞蝗、卵葉山螞蝗及長波葉山螞蝗；異葉山螞蝗的相對發(fā)芽勢最高(30.56%)，極顯著高于顯脈山螞蝗及長波葉山螞蝗；當(dāng)鹽濃度上升到12 g·L-1時(shí)，長波葉山螞蝗和卵葉山螞蝗未發(fā)芽，僅假地豆、異葉山螞蝗、顯脈山螞蝗、糙伏山螞蝗有少許發(fā)芽，其中，假地豆的相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽勢均最高，分別為29.44%、6.67%。

3.1.2鹽脅迫對山螞蝗種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由表4可以看出，隨著鹽濃度的升高，6份山螞蝗屬種質(zhì)材料的發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，并且各品種間表現(xiàn)出顯著差異。根據(jù)方差分析表明，所有鹽處理對6份種質(zhì)材料的發(fā)芽指數(shù)均有極顯著影響(p<0.01)；同一濃度下各材料間發(fā)芽指數(shù)變異系數(shù)隨鹽濃度增加呈逐漸增加趨勢，對照的變異系數(shù)為0.34，而當(dāng)鹽濃度為12 g·L-1時(shí)，變異系數(shù)達(dá)1.03，說明高鹽濃度下材料間的發(fā)芽指數(shù)差異較大，表現(xiàn)出對高鹽適應(yīng)性的不一致。在不同NaCl濃度下，假地豆的發(fā)芽指數(shù)均表現(xiàn)優(yōu)于其他5份種質(zhì)，說明假地豆的種子活力較強(qiáng)，在山螞蝗屬中表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性。

3.1.3鹽脅迫對山螞蝗種質(zhì)苗重的影響

對不同濃度NaCl脅迫下6份山螞蝗屬種質(zhì)進(jìn)行10株幼苗苗重測定(圖4)表明，隨著鹽濃度的上升，假地豆、異葉山螞蝗、卵葉山螞蝗的苗重呈下降趨勢，顯脈山螞蝗、長波葉山螞蝗和糙伏山螞蟥卻呈不規(guī)則變化，不同種間在同一濃度下表現(xiàn)出顯著差異(p<0.05)。對同一濃度下不同品種的苗重進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，在不同鹽濃度下，顯脈山螞蝗均與其他種之間存在顯著差異(p<0.05)；隨著鹽脅迫濃度的升高，各種間的降幅也隨之增加。

3.1.4鹽脅迫對山螞蝗胚根長及胚芽長的影響

由圖5可以看出，隨著鹽濃度的上升，6份山螞蝗屬種質(zhì)材料的胚根長均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。經(jīng)方差分析可知，在0～9 g·L-1的鹽濃度范圍內(nèi)，不同品種間的胚根長呈不同程度的顯著差異，當(dāng)鹽濃度上升到12 g·L-1時(shí)，假地豆的胚根長最長，與其他品種存在顯著差異(p<0.05)，而其余5個(gè)品種間沒有差異；當(dāng)鹽濃度上升到15 g·L-1時(shí)，各品種間均不存在差異，因此對于篩選耐鹽性品種的意義不大。

由圖6可以看出，隨著鹽濃度的升高，除了糙伏山螞蟥外，其他5個(gè)種質(zhì)材料的胚芽長均呈下降趨勢。在0～3 g·L-1的鹽濃度范圍內(nèi)，6份山螞蝗種質(zhì)材料的胚芽長的下降速率均比較低，表明這6份種質(zhì)材料對低鹽濃度具有一定的適應(yīng)性。經(jīng)方差分析可知，在0～9 g·L-1的鹽濃度范圍內(nèi)不同品種間呈顯著差異(p<0.05)，當(dāng)鹽濃度上升至12 g·L-1時(shí)，顯脈山螞蝗與其他品種具有顯著差異。

3.1.5不同濃度鹽處理下山螞蝗屬種質(zhì)的耐鹽濃度、鹽極限濃度以及耐鹽半致死濃度

由表2可以看出，假地豆的耐鹽濃度最高，說明假地豆對鹽濃度具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，并且其鹽極限濃度和耐鹽半致死濃度均最大，因此可以初步判定假地豆的耐鹽性最強(qiáng)；異葉山螞蝗和顯脈山螞蝗的3個(gè)濃度均一樣，可以初步表明兩者的耐鹽性相差不大；長波葉山螞蝗、糙伏山螞蟥和卵葉山螞蝗三者耐鹽濃度一樣，但相比來說糙伏山螞蟥對高鹽濃度的適應(yīng)性更強(qiáng)。

表2 山螞蝗屬種質(zhì)的耐鹽濃度、鹽極限濃度以及耐鹽半致死濃度Table 2 Comparasion of the salt-tolerant concentration,the limiting salt concentration and the half-lethal concentration of salt tolerance in Desmodium germplasms

3.1.6山螞蝗萌芽期耐鹽性綜合評價(jià)

一般而言，采用隸屬函數(shù)法對植物抗逆性進(jìn)行評價(jià)時(shí)，某材料的綜合評價(jià)值越高，其抗性就越強(qiáng)，反之就越弱。通過隸屬函數(shù)法對6份山螞蝗屬種質(zhì)材料進(jìn)行耐鹽性綜合評價(jià)(見表3)，耐鹽性強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭俚囟?顯脈山螞蝗>糙伏山螞蝗>異葉山螞蝗>卵葉山螞蝗>長波葉山螞蝗。

表3 不同NaCl濃度下山螞蝗屬種質(zhì)萌芽期耐鹽綜合評價(jià)Table 3 Comprehensive evaluation on salt tolerance of Desmodium germplasms at germination stage with different NaCl concentrations

3.2 鹽脅迫對山螞蝗苗期生長發(fā)育的影響

3.2.1鹽脅迫對山螞蝗株高的影響

鹽濃度的升高會阻礙植株的生長。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著鹽濃度的升高，山螞蝗幼苗的生長明顯受到抑制，且不同的材料之間對鹽脅迫的耐受能力差異較大(表4)。鹽脅迫處理后，除異葉山螞蝗的株高呈先增高后下降趨勢外，其他材料均表現(xiàn)為下降趨勢，說明異葉山螞蝗在低鹽濃度有較強(qiáng)的耐受性。在同一濃度下對不同材料進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同鹽濃度下各材料間均表現(xiàn)出明顯差異(p<0.05)。

表4 不同鹽濃度下植株高度的變化Table 4 Variation of plant height under different salt concentrations

3.2.2鹽脅迫對山螞蝗葉綠素含量的影響

耐鹽性高的植物具有較高的葉綠素，可以維持植物自身較高的光合速率，從而保持自身的正常生長。從表5可以看出，隨著鹽濃度的升高，山螞蝗幼苗表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，但不同種的山螞蝗在鹽脅迫下表現(xiàn)出不同程度的差異。假地豆、顯脈山螞蝗、長波葉山螞蝗和卵葉山螞蝗在3 g·L-1時(shí)變幅最大，而異葉山螞蝗和糙伏山螞蟥在6 g·L-1時(shí)變幅最大。

表5 不同鹽濃度下葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 5 Changes of chlorophyll content in leaves under different salt concentrations

3.2.3鹽脅迫對山螞蝗質(zhì)膜透性的影響

細(xì)胞質(zhì)膜透性小，說明在鹽脅迫下的外滲物較少，耐鹽性較強(qiáng)。并且耐鹽性強(qiáng)的材料細(xì)胞膜受害較輕，質(zhì)膜透性的變化幅度也較小。由表6可知，隨著鹽濃度的升高，山螞蝗葉片質(zhì)膜透性顯著升高，不同種間也表現(xiàn)出顯著差異(p<0.05)。當(dāng)鹽濃度上升至9 g·L-1時(shí)，6份材料的葉片質(zhì)膜透性均達(dá)到最大。與對照相比糙伏山螞蟥變幅最大，為144.53%，長波葉山螞蝗變幅最小，為64.42%。

表6 不同鹽濃度下葉片質(zhì)膜透性的變化Table 6 Changes of membrane permeability in leaves under different salt concentrations

3.2.4鹽脅迫對Pro含量的影響

在鹽脅迫下，Pro含量會迅速上升。試驗(yàn)結(jié)果(表7)表明，隨著鹽濃度的升高，植株體內(nèi)的Pro含量呈上升趨勢，并且在鹽濃度達(dá)到9 g·L-1時(shí)，Pro含量達(dá)到最大。在0～3 g·L-1的鹽濃度內(nèi)，山螞蝗各種間表現(xiàn)出顯著差異(p<0.05)；當(dāng)鹽濃度上升至6 g·L-1時(shí)，各種間不再表現(xiàn)出差異(p>0.05)，并且在9 g·L-1時(shí)，山螞蝗各種間的變幅最大。

表7 不同濃度下葉片Pro含量的變化Table 7 Changes of proline (Pro) content in leaves under different salt concentrations

3.2.5鹽脅迫對MDA含量的影響

一般認(rèn)為MDA的含量越高，植物體的抗性就會越弱。由表8可知，隨著鹽濃度的升高，植物體內(nèi)的MDA含量也隨之增大，說明植物的抗性逐漸變?nèi)?，即鹽脅迫影響越大。在同一濃度對不同種進(jìn)行方差分析可得，不同種間存在顯著差異(p<0.05)。當(dāng)鹽濃度上升為9 g·L-1時(shí)，假地豆變幅最大，為212.99%，異葉山螞蝗的變幅最小，為40.42%。

表8 不同濃度下葉片MDA含量的變化Table 8 Changes of malondialdehyde (MDA) in leaves under different salt concentrations

3.2.6山螞蝗苗期耐鹽性綜合評價(jià)

通過隸屬函數(shù)法對6份山螞蝗屬種質(zhì)材料進(jìn)行耐鹽性綜合評價(jià)(見表9)，耐鹽性強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭俚囟?顯脈山螞蝗>糙伏山螞蝗>卵葉山螞蝗>異葉山螞蝗>長波葉山螞蝗。

表9 山螞蝗苗期隸屬函數(shù)值及綜合評價(jià)Table 9 Comparasion of subordinative function value and comprehensive evaluation in Desmodium germplasms

4 討 論

研究表明，種質(zhì)萌芽期和苗期對鹽脅迫的反應(yīng)最為敏感[11-12]。而植株的耐鹽程度決定了植物種子的萌發(fā)狀態(tài)及苗期的生長發(fā)育，因此耐鹽性評價(jià)多從種子萌發(fā)狀況(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù))和苗期生長狀態(tài)(株高、葉綠素含量。質(zhì)膜透性、Pro含量等)進(jìn)行綜合考慮，但會因植物種類的不同導(dǎo)致其對鹽脅迫的響應(yīng)存在一定差異。鹽脅迫對種子的影響是多方面的，不僅表現(xiàn)在形態(tài)方面，同時(shí)也會表現(xiàn)在具體的生理生化過程中。同時(shí)，由于多指標(biāo)對耐鹽的反應(yīng)程度不一致，因此一般采用多個(gè)指標(biāo)結(jié)合隸屬函數(shù)的方法[13-14]或打分法[15]等對材料耐鹽性進(jìn)行研究。本試驗(yàn)通過對山螞蝗種子萌芽期形態(tài)指標(biāo)的測定和苗期生理指標(biāo)的測定，運(yùn)用隸屬函數(shù)，共同探討山螞蝗種質(zhì)的耐鹽性。

本研究表明，隨著鹽脅迫濃度的上升，山螞蝗種子的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)和幼苗期的株高、葉綠素含量均表現(xiàn)出下降趨勢，說明鹽脅迫會降低種子生理活力，抑制種子正常生長發(fā)育。

鹽脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧自由基，對細(xì)胞膜脂造成直接損傷，電解質(zhì)外滲率能反映膜系統(tǒng)的完整性，電解質(zhì)外滲越多，細(xì)胞膜的損傷程度越大，MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，可衡量膜損傷程度的大小[16]。本研究結(jié)果表明，山螞蝗幼苗期隨脅迫時(shí)間延長和脅迫程度加劇，質(zhì)膜透性和MDA含量逐漸增加，與馮宇等[17]對豇豆耐鹽性的研究結(jié)果相似。游離氨基酸有助于保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，清除活性氧以及穩(wěn)定酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[18]。Pro作為滲透調(diào)節(jié)劑在逆境時(shí)協(xié)助植物體抵御滲透脅迫帶來的傷害，NaCl的添加促進(jìn)Pro積累，Pro保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，從而提高了植物的抗逆性。因此，在本研究中，隨著鹽濃度的增加，Pro含量也逐漸增加。

通過多重比較可得，同一濃度下6份山螞蝗種質(zhì)間表現(xiàn)出明顯差異，說明不同種間對鹽脅迫的耐性不同。通過隸屬函數(shù)值的方法對參試的6份山螞蝗種質(zhì)材料萌芽期和苗期分別進(jìn)行分析，兩次綜合評價(jià)都得出假地豆的耐鹽性最強(qiáng)，說明假地豆萌芽期和苗期的耐鹽性都較好，可作為耐鹽品種選育；其余5份山螞蝗在萌芽期和苗期分別表現(xiàn)出不同的耐鹽性。異葉山螞蝗在萌芽期的耐鹽性較卵葉山螞蝗強(qiáng)，但在苗期，其耐鹽性弱于卵葉山螞蝗。長波葉山螞蝗在萌芽期及苗期的耐鹽性評價(jià)都表現(xiàn)最弱，因此在培育長波葉山螞蝗時(shí)應(yīng)當(dāng)注意鹽濃度的變化，以保證種子的正常萌芽和苗期的正常發(fā)育。

5 結(jié) 論

在山螞蝗芽期階段，隨著鹽脅迫濃度的增加，6份山螞蝗屬種質(zhì)間的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、苗重、胚根長以及胚芽長均表現(xiàn)出不同程度的差異；6份山螞蝗種質(zhì)的耐鹽濃度為3～9 g·L-1，鹽極限濃度為9～12 g·L-1，耐鹽半致死濃度為6～9 g·L-1，其中假地豆的耐鹽濃度、鹽極限濃度和耐鹽半致死濃度均最大，分別為9、12、9 g·L-1；通過隸屬函數(shù)綜合評價(jià)參試材料的耐鹽性，認(rèn)為假地豆和顯脈山螞蝗的耐鹽性較強(qiáng)。

在山螞蝗苗期階段，隨著鹽濃度的增加，6份山螞蝗屬種質(zhì)的質(zhì)膜透性、Pro含量、MDA含量均表現(xiàn)出上升趨勢，葉綠素含量呈下降趨勢，且種質(zhì)間均存在不同程度的差異。通過隸屬函數(shù)法對6份山螞蝗屬種質(zhì)材料進(jìn)行耐鹽性綜合評價(jià)，耐鹽性強(qiáng)弱順序?yàn)椋杭俚囟?顯脈山螞蝗>糙伏山螞蝗>卵葉山螞蝗>異葉山螞蝗>長波葉山螞蝗。