王 險(xiǎn)， 楊 杰

(1.北京觀韜中茂律師事務(wù)所，北京 100032；2.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100160)

蝗蟲俗稱螞蚱，是農(nóng)田中常見的一種昆蟲，蝗蟲主要發(fā)生在熱帶、溫帶草原和沙漠地區(qū)，蝗蟲的食性雜、食量大，喜食小麥、水稻、谷子、玉米、蔬菜等農(nóng)作物，食物匱乏時(shí)豆類、煙草、蘆葦、果樹、林木及雜草的葉子、嫩莖、花蕾和嫩果等植物均會受到蝗蟲的危害，蝗蟲每天都要吃掉和自己的體重相當(dāng)?shù)氖澄?，一旦成?zāi)，有可能導(dǎo)致糧食顆粒無收，嚴(yán)重威脅我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。目前防治蝗蟲主要是采用化學(xué)農(nóng)藥防治的方法，盡管化學(xué)防治可以迅速壓低蝗蟲的蟲口密度，但是往往造成污染環(huán)境、殺傷大量有益動物、人畜中毒和害蟲產(chǎn)生抗藥性等不良后果。生物農(nóng)藥治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不殺傷天敵、對環(huán)境友好、對人畜安全，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本文通過incoPat科技創(chuàng)新情報(bào)平臺(IncoPat收錄了全球102個(gè)國家/組織/地區(qū)1億余件專利信息)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用關(guān)鍵詞及分類號(蝗蟲、螞蚱、locust、locusts、grasshopper、A01N63、C12N、C12R、A01P7/06、A01P7/04、A01P7/02、A01P7/00)對2000年01月01日至2020年10月15日之間的專利數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索統(tǒng)計(jì)。通過全面分析生物方法防治蝗蟲的中國專利申請態(tài)勢、重點(diǎn)申請人狀況和專利技術(shù)分析，為生物防治蝗蟲提供專利信息支撐。

1 中國專利申請態(tài)勢

(圖1)給出了生物防治蝗蟲的申請趨勢?？梢钥闯觯锓乐位认x的專利數(shù)量并不是很多，發(fā)展也比較晚。2013年以前每年申請的專利數(shù)量少于10件，2013年以后申請的數(shù)量逐漸增加，但是到2019年每年的申請數(shù)量也未能突破30件。申請數(shù)量的統(tǒng)計(jì)范圍是目前已公開的專利。由于時(shí)間原因，部分新申請的專利可能還處于未公開的狀況，導(dǎo)致(圖1)2020年的申請量出現(xiàn)偏低的情況。

圖1 生物防治蝗蟲專利申請趨勢

2 主要申請人的申請量趨勢

(圖2)可以看出，國內(nèi)申請人主要以高校和研究所為主，其中山西大學(xué)是生物防治蝗蟲領(lǐng)域申請量最多的申請人，從2000年至今年累計(jì)申請量達(dá)到42件。排名第二的是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，申請量達(dá)25件，明顯高于其余申請人。

圖2 主要申請人的申請量排名

3 國內(nèi)主要申請人的重點(diǎn)研究方向

3.1 山西大學(xué) (圖3)可以看出，山西大學(xué)在蝗蟲生物防治研究方面主要著力與RNAi干擾技術(shù)的研究。RNA干擾(RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為人類的疾病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。山西大學(xué)主要研究了通過不同的基因干擾昆蟲幾丁質(zhì)、昆蟲表皮酯質(zhì)合成、表皮蛋白等影響抑制蝗蟲蛻皮，達(dá)到殺死蝗蟲的效果。

3.2 中國農(nóng)科院植物保護(hù)研究所 (圖4)顯示中國農(nóng)科院植保保護(hù)研究所在RNAi干擾、真菌防治、通過基因引起免疫抑制反應(yīng)調(diào)節(jié)真菌對蝗蟲侵染的效果等方面都進(jìn)行了一定的研究。RNAi干擾技術(shù)著力研究相關(guān)基因干擾蝗蟲的生長發(fā)育，通過干擾蝗蟲的發(fā)育達(dá)到防治蝗蟲的目的。真菌防治方面，中國農(nóng)科院植保研究所主要研究了相關(guān)蛋白基因增強(qiáng)綠僵菌殺滅蝗蟲的效率，綠僵菌及金龜子綠僵菌與相關(guān)化藥的組合物。中國農(nóng)科院植保所還通過相關(guān)基因?qū)е禄认x產(chǎn)生免疫的應(yīng)答達(dá)到致死蝗蟲的效果。

圖4 中國農(nóng)科院植保所蝗蟲研究方向

3.3 四川大學(xué) 申請人發(fā)現(xiàn)一種殺蟲蛋白所致.該蛋白分子量為25100 Da，經(jīng)研究表明該菌無芽孢，本身具有較強(qiáng)毒蛋白，具有構(gòu)建成為遺傳工程菌廣泛用于生物防治的潛力。(圖5)可知四川大學(xué)在抗殺蟲基因技術(shù)上做了相關(guān)研究。此外，申請人還對真菌及植物來源的活性化合物對蝗蟲的防治進(jìn)行了相關(guān)研究。

圖5 四川大學(xué)蝗蟲防治研究方向

3.4 重慶大學(xué) (圖6)可以看出重慶大學(xué)在RNAi干擾技術(shù)和真菌防治蝗蟲方面進(jìn)行了研究。重慶大學(xué)研究了ATP合酶α和β亞基基因cDNA的保守序列，并構(gòu)建其RNA、DNA等構(gòu)建體，利用RNAi技術(shù)沉默蝗蟲體內(nèi)ATP合酶α亞基，使體內(nèi)ATP合酶α亞基的表達(dá)明顯受到抑制，導(dǎo)致蝗蟲產(chǎn)生致死效應(yīng)，可應(yīng)用于RNAi技術(shù)對東亞飛蝗害蟲防治。重慶大學(xué)還研究了蝗綠僵菌工程菌株的制備和綠僵菌及綠僵菌和化學(xué)農(nóng)藥的組合物進(jìn)行蝗蟲防治。

圖6 重慶大學(xué)蝗蟲防治研究方向

3.5 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動物，只對蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性，對脊椎動物完全無致病性，在田間使用過程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低，在防治蝗蟲災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競爭力。(圖7)可以看到中國農(nóng)業(yè)大學(xué)主要研究方向是蝗蟲微孢子在防治蝗蟲方面的應(yīng)用。

圖7 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)蝗蟲防治研究方向

4 生物防治蝗蟲專利技術(shù)分析

通過國內(nèi)主要申請人生物防治蝗蟲的研究方向分析可以看出，我國在蝗蟲生物防治方面主要研究方向集中在以下三個(gè)方面：1、RNA干擾技術(shù)；2、真菌防治；3、蝗蟲微孢子。

4.1 RNA干擾技術(shù) RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，自2006年獲得諾貝爾獎以來，RNAi技術(shù)一直躋身于科技前沿。RNAi不僅是研究基因功能的有力工具，同時(shí)在害蟲防治方面也具有極大潛力。通過RNA干擾進(jìn)行害蟲防治具有如下特點(diǎn)：1)殺蟲具有專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解，無殘留；3)對環(huán)境無毒無害，相對安全。因此學(xué)者將其稱為第四代殺蟲劑?；赗NA干擾進(jìn)行害蟲防治的基礎(chǔ)技術(shù)是篩選靶標(biāo)序列獲得具有高致死作用的dsRNA。廣泛用于昆蟲RNAi實(shí)驗(yàn)的基本方法有兩種。一種方法是采用體外合成的dsRNA，然后將其導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中，稱為外源性RNAi；另一種方法是用DNA表達(dá)載體導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中，在體內(nèi)或細(xì)胞中表達(dá)時(shí)合成dsRNA，稱為內(nèi)源性RNAi。盡管內(nèi)源性方法可以在昆蟲生活史的任何時(shí)間實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性或組織特異性的RNAi，具有遺傳性等優(yōu)點(diǎn)，但由于很多昆蟲還沒有建立成功的轉(zhuǎn)基因體系，所以這種方法目前還并不適合許多昆蟲的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重點(diǎn)手段。國內(nèi)申請人研究的方向也主要是通過篩選基因序列合成相關(guān)的dsRNA，然后將其導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)或細(xì)胞中進(jìn)行防治蝗蟲研究。

4.2 真菌防治 昆蟲病原真菌是昆蟲病原生物中的最大類群。據(jù)野外調(diào)查越冬昆蟲發(fā)現(xiàn)，昆蟲疾病中約有60%是由真菌引起的，病原真菌也是最早被系統(tǒng)地利用來控制害蟲的昆蟲病原微生物?；认x的主要病原真菌，包括綠僵菌M.anisopliae、白僵菌B.bassiana、黃綠僵菌M.flavoviride、黃曲霉菌Aspergillus flavus等[1]。我國申請人中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、重慶大學(xué)、四川大學(xué)、中科院動物研究所、江西天人生態(tài)股份有限公司等都對對綠僵菌、白僵菌進(jìn)行了相關(guān)研究，也有對蛋白或化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌或白僵菌組合來提高相應(yīng)真菌的殺蟲效果的研究。

白僵菌是一種半知菌類的蟲生真菌，可以侵入6個(gè)目15科200多種昆蟲、螨類的蟲體內(nèi)大量繁殖，同時(shí)不斷產(chǎn)生白僵素(大環(huán)脂類毒素)和草酸鈣結(jié)晶，這些物質(zhì)可引起昆蟲中毒，使體液發(fā)現(xiàn)機(jī)能發(fā)生變化，打亂新陳代謝以致死亡。金龜子綠僵菌屬于半知菌亞門綠僵菌屬，是一種廣譜的昆蟲病原真菌，可寄生于多種昆蟲體內(nèi)。綠僵菌具有顯著的殺蟲效果，并且具有不同于現(xiàn)有殺蟲劑的全新的作用機(jī)理，主要作用于昆蟲血淋巴免疫系統(tǒng)，使之喪失免疫防御功能。白僵菌和綠僵菌制劑對人、畜無毒，對作物安全，無殘留、無污染，但能感染家蠶幼蟲，形成僵蠶病。因此，百僵菌和綠僵菌制劑防治蝗蟲具有較強(qiáng)的優(yōu)勢。

4.3 蝗蟲微孢子 蝗蟲微孢子Nosema(Paranosema)locustae 是一種可以侵染100多種直翅目昆蟲的單細(xì)胞真核病原微生物，其在田間的應(yīng)用范圍非常廣泛?；认x取食了被蝗蟲微孢子污染過的食物后，孢子即在蝗蟲消化道中萌發(fā)，暴發(fā)性地突出極絲尖端，穿進(jìn)寄主細(xì)胞和中腸腸壁細(xì)胞，到達(dá)血腔，進(jìn)入感受性組織細(xì)胞如在脂肪體中開始無性裂殖生殖，將孢子的孢原質(zhì)釋放出來，開始在寄主的細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，消耗蝗蟲體內(nèi)的能源物質(zhì)，導(dǎo)致蟲體總脂含量和血淋巴甘油脂含量大幅度下降及血淋巴脂肪酶活力大幅度上升，使蝗蟲出現(xiàn)畸形，發(fā)育期延長，壽命縮短，喪失生殖能力。此外，微孢子還可侵染蝗蟲的唾腺、圍心細(xì)胞及神經(jīng)組織；在其病蟲體內(nèi)的卵細(xì)胞、側(cè)輸卵管、中輸卵管中均發(fā)現(xiàn)有微孢子，產(chǎn)卵量下降約50%，孵化率極低，取食量下降，隨著微孢子在寄主體內(nèi)不斷增殖，使寄主的生理機(jī)能等遭到破壞而死亡。蝗蟲微孢子不污染環(huán)境、不殺傷天敵、對人畜安全，不產(chǎn)生對其他生物的二次毒害，有利于保護(hù)生物多樣性。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)針對蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷，從從田間患病的東亞飛蝗中分離篩選得到蝗蟲微孢子蟲(Antonospora locustae)，命名為AL2008L-04株系，結(jié)果表明，AL2008-01株系具有良好的致病力，提高蝗蟲微孢子蟲的毒力。

5 結(jié)語

通過專利數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和技術(shù)分析可以看出，我國生物防治蝗蟲的研發(fā)主體集中在高校和研究所，研究的重點(diǎn)在使用RNA干擾技術(shù)。RNA干擾技術(shù)具有殺蟲具有專一性，對非靶標(biāo)生物無殺傷作用；RNA在自然界極易降解，無殘留；對環(huán)境無毒無害，相對安全等優(yōu)點(diǎn)。其研究的機(jī)理是通過選擇合適的基因序列然后在體外合成的dsRNA，將合成的dsRNA在注入蝗蟲體內(nèi)。這樣的方法在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域大規(guī)模防治蝗蟲上存在施用困難的缺點(diǎn)。因此，研發(fā)適用大規(guī)模防治蝗蟲的RNA干擾技術(shù)是未來發(fā)展的方向。

昆蟲病原真菌，相較于化學(xué)殺蟲劑，具有環(huán)境友好、抗逆性強(qiáng)、能大量擴(kuò)散、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，是廣泛應(yīng)用的一類生物農(nóng)藥。然而，目前昆蟲病原真菌作為殺蟲劑仍然存在著致死時(shí)間較長的缺點(diǎn)。通過研究真菌致病機(jī)理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌殺蟲劑的效果是當(dāng)前研究的一個(gè)重要方向。

蝗蟲微孢子蟲是一種蝗蟲專性的寄生原生動物，只對蝗蟲等直翅目昆蟲有致病性，對脊椎動物完全無致病性，實(shí)驗(yàn)研究證明對蜜蜂也不感染，安全性好，而且該病原物在田間使用過程受環(huán)境條件的限制較小、生產(chǎn)成低，因此在防治蝗蟲災(zāi)害的方面有很強(qiáng)競爭力?？朔?dāng)前蝗蟲微孢子蟲的致病力一般較弱的缺陷，篩選合適的蝗蟲微孢子蟲提高蝗蟲微孢子蟲的毒力是該領(lǐng)域值得關(guān)注的研發(fā)方向。