黃雅瓊，李文周，陳 斌，蔡孝星，鄭志學(xué)，呂植桐

(1.福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，福建 德化 362500；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

蛙科(Ranidae)琴蛙屬(Nidirana)物種廣泛分布于東亞和東南亞的亞熱帶地區(qū)，目前該屬共有已知物種14種，且所有已知種在我國均有分布[1]。彈琴蛙(N.adenopleura)是琴蛙屬中命名較早的物種之一，曾經(jīng)是該屬中分布范圍最廣的物種，被廣泛記錄于我國華東、華南、西南等地[2]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及綜合分類法的應(yīng)用，原先曾被鑒定為彈琴蛙的多個不同種群，先后被發(fā)表為新物種[1，3-4]。其中，分布于廣西大瑤山的種群被認(rèn)定為瑤琴蛙(N.yaoica)，分布于貴州雷公山和梵凈山的種群被認(rèn)定為雷山琴蛙(N.leishanensis)，分布于湖南湘江流域的種群被認(rèn)定為湘琴蛙(N.xiangica)，分布于浙江北部的種群被認(rèn)定為孟聞琴蛙(N.mangveni)，分布于廣東北部、湖南東南部和江西西南部的種群為粵琴蛙(N.guangdongensis)。

分布于福建省的琴蛙種群，此前也均被鑒定為彈琴蛙[2，5-6]。此后，經(jīng)過形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析研究，福建北部的種群被確認(rèn)為是真正的彈琴蛙[1，7]，而福建南部的琴蛙種群目前仍缺乏相關(guān)厘定。2017年6月，在福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)采集到4號琴蛙屬標(biāo)本，經(jīng)過詳細(xì)的形態(tài)比較和分子系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為粵琴蛙，為福建省兩棲類新記錄。本發(fā)現(xiàn)為琴蛙屬的系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

4號琴蛙標(biāo)本是2017年6月26日夜晚徒手采集自福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)九仙山(118°06′44.20″E、25°41′39.96″N)。標(biāo)本安樂死后，剪取大腿腹側(cè)肌肉樣品保存于95%乙醇中；標(biāo)本用5%福爾馬林溶液固定定型后轉(zhuǎn)移至70%乙醇溶液中，保存于中山大學(xué)生物博物館(SYS)。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

使用游標(biāo)卡尺對4號標(biāo)本的形態(tài)特征進(jìn)行測量，精確到0.1 mm。測量標(biāo)準(zhǔn)及形態(tài)特征鑒定均依照 Lyu 等[1]的定義。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

使用Tiangen Genomic DNA Kit試劑盒提取樣品的基因組DNA(方法參照其說明書)，提取的DNA溶液保存于-20 ℃?zhèn)溆?。利用PCR擴(kuò)增線粒體COⅠ基因片段。擴(kuò)增引物參照Lyu等[1]的 dgLCO (5′-GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGG-3′) 和dgHCO(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA-3′)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min，隨后以94 ℃變性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃復(fù)性1 min進(jìn)行35個循環(huán)，最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，所得序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 序列分析及分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載琴蛙屬部分物種及其近緣類群拇棘蛙屬(BabinaThompson)，1912物種的相關(guān)COⅠ基因序列(表1)。拇棘蛙屬物種作為構(gòu)建分子系統(tǒng)樹的外群[7]。所有序列在MEGA 6.0軟件[8]中使用Clustal W算法[9]進(jìn)行序列比對，采用默認(rèn)參數(shù)。比對后的序列在jModelTest v2軟件中基于AIC標(biāo)準(zhǔn)計算最佳核苷酸替代模型；用MEGA 6.0 軟件的p-distance距離模型計算各物種間的遺傳距離；使用RaxmlGUI 1.3軟件[10]，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次bootstrap重復(fù)抽樣分析以檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹各節(jié)點(diǎn)置信度。

表1 所有樣品的采集信息、標(biāo)本憑證和GenBank序列號

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定及比較

采集自福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)的4號琴蛙標(biāo)本為3雄1雌(圖1)，所有標(biāo)本的形態(tài)量度結(jié)果見表2，其形態(tài)符合粵琴蛙的鑒定特征。

A1.雄性背面；A2.雄性腹面；B1.雌性背面；B2.雌性腹面

體型大，雄性頭體長53.1～53.6 mm，雌性頭體長56.6 mm。頭長大于頭寬；吻端鈍圓，突出于下唇，吻長大于眼徑；吻棱明顯，頰部向內(nèi)略微凹陷；鼻孔位于吻、眼之間，略近于吻端；眼間具顯著松果體；眼間距小于鼻間距；鼓膜清晰，小于眼徑，接近眼；不具顳褶；具犁骨棱和犁骨齒；舌末端具缺刻。雄性具一對咽下外聲囊。

前肢較粗壯；指細(xì)長，指序為Ⅱ<Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ；指末端略膨大成吸盤，除I指外均具腹側(cè)溝；無蹼，Ⅰ指外側(cè)及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ指內(nèi)外側(cè)具顯著緣膜；關(guān)節(jié)下瘤顯著，各指基部具不明顯的指基下瘤；掌突3個，橢圓形、大而顯著。雄性第I指基部背面具單個婚墊，無婚刺。

后肢相對粗壯，后肢前伸貼體時脛跗關(guān)節(jié)達(dá)鼻孔，跟部重疊；趾細(xì)長，趾序為Ⅰ<Ⅱ<Ⅴ<Ⅲ<Ⅳ；趾末端略膨大成長而尖的吸盤，各趾均具顯著腹側(cè)溝；腳蹼中等大小，蹼式：Ⅰ1～2Ⅱ1～2Ⅲ1～3Ⅳ 3Ⅴ～1V；各趾內(nèi)外側(cè)均具顯著緣膜；關(guān)節(jié)下瘤顯著；內(nèi)蹠突橢圓形，長約為寬的3倍；外蹠突不顯著，小而圓。

表2 福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)度量粵琴蛙標(biāo)本的形態(tài)度量

背部皮膚粗糙；后背部及后肢密被錐狀角質(zhì)刺，頭部及體背具稀疏的角質(zhì)刺；背側(cè)褶發(fā)達(dá)，自上眼瞼后緣延伸至腹股溝上方，末端斷斷續(xù)續(xù)，具稀疏角質(zhì)刺；雄性體側(cè)粗糙，具小疣及稀疏角質(zhì)刺，具顯著、光滑、略微凸起的肩上腺；雌性體側(cè)較光滑，不具角質(zhì)刺，不具肩上腺。腹面光滑，腿后部及肛周圍具扁平疣。

生活時背面棕紅色，角質(zhì)刺白色；松果體黃色；背部具斷續(xù)的黃色背中線，自松果體延伸至肛部上方；體側(cè)上部灰褐色，下部淺黃色，肩上腺米黃色。前肢淺褐色，具黑色條紋；后肢深褐色，具黑色橫紋。頰部及顳部棕色，鼓膜淺褐色；虹膜上1/3淺褐色、下2/3紅棕色。腹面白色；雄性咽部粉色。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

PCR擴(kuò)增獲得福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)琴蛙線粒體COⅠ基因序列4條，長度各569 bp。用于系統(tǒng)發(fā)育分析的最佳核苷酸替代模型為GTR+G+I。最大似然系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，采自福建戴云山自然保護(hù)區(qū)的琴蛙標(biāo)本與廣東北部、湖南東南部、江西西南部的粵琴蛙樣品聚為支持率較高(99%)的單系群，而與福建北部、江西中部、浙江南部、臺灣的彈琴蛙樣品親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)?；趐-distance距離模型估算的遺傳距離(表3)顯示，福建戴云山國家級保護(hù)區(qū)的琴蛙種群內(nèi)部遺傳距離為0.1%；與廣東北部、湖南東南部、江西西南部的粵琴蛙種群遺傳距離為1.8%，略大于該種群內(nèi)部的遺傳距離(1.3%)；與彈琴蛙的遺傳距離為9.4%。分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果支持福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)的琴蛙標(biāo)本為粵琴蛙，而非原文獻(xiàn)記錄的彈琴蛙[2，5-6]。

表3 基于線粒體CO Ⅰ基因的琴蛙屬物種間p-distance遺傳距離

表3(續(xù))

分支末端數(shù)字為樣品序號，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字為最大似然法自舉值

3 討論

粵琴蛙為2020年新發(fā)表的兩棲動物新物種，在此之前已知的分布范圍為廣東北部、湖南東南部、江西南部的南嶺山脈中段及羅霄山脈南部[1]。本次在福建中部的戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)報道該物種的新分布，是福建省兩棲類新記錄。這一發(fā)現(xiàn)，將粵琴蛙的分布區(qū)域向東擴(kuò)展至福建中部(圖3)。此前，福建北部、江西中部的琴蛙種群已被確認(rèn)為彈琴蛙[1，7]。因此，可以推測從廣東北部沿南嶺山脈、蓮花山脈往東的閩南、粵東、贛南等地此前記錄的彈琴蛙種群也應(yīng)該是粵琴蛙。在這些地區(qū)需要進(jìn)行全面和詳細(xì)的調(diào)查，以了解這一新物種確切的分布范圍及種群狀況。

戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)位于福建中部的戴云山脈，其北部為福建最大河流閩江。目前已經(jīng)報道確認(rèn)過的福建北部的彈琴蛙種群[1，7]，均分布于閩江以北；而此次報道的粵琴蛙種群分布于閩江以南的戴云山。這也表明，閩江可能是彈琴蛙和粵琴蛙2個物種在福建省內(nèi)分布區(qū)的分界線。

星形為福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)；紅色圓形為此前報道的粵琴蛙分布點(diǎn)；黑色圓形為此前報道的彈琴蛙分布點(diǎn)；右上方小圖為福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)粵琴蛙生境。

*：感謝福建戴云山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局賴鐘俊、陳文偉、徐榮地、陳亞婷，中山大學(xué)王英永、王健協(xié)助完成室內(nèi)實(shí)驗、野外調(diào)查工作，并對本論文提供了寶貴建議和幫助。