李劍蘭 余璇 胡青婷 左丹丹

PD是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，與環(huán)境和遺傳因素密切相關(guān)。研究表明，腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)之間存在相互作用[1-3]。腸道菌群有助于調(diào)節(jié)腸胃蠕動(dòng)，促進(jìn)營養(yǎng)吸收和代謝，調(diào)節(jié)黏膜免疫功能并維持腸道健康。胃腸道功能障礙在PD病人中早于運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生，被認(rèn)為是PD的早期癥狀[4-5]。腸道菌群可能將腸道作為載體，將病變擴(kuò)散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致PD的發(fā)生發(fā)展[6]。此外，某些腸道產(chǎn)短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)細(xì)菌豐度水平與PD之間密切相關(guān)，而SCFAs可調(diào)節(jié)腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的活性，從而增加腸胃蠕動(dòng)，改善PD的早期癥狀[7]。此外，SCFAs還具有調(diào)節(jié)免疫、改善炎性反應(yīng)的作用[8]。PD與腸道菌群的相關(guān)性研究已有報(bào)道，但PD是否與SCFAs和炎癥因子之間存在相關(guān)性鮮有報(bào)道。本文選取人腸道梭菌簇IV和梭菌簇XIVa兩大優(yōu)勢(shì)菌群中產(chǎn)SCFAs細(xì)菌普拉梭菌(F.prausnitzii)和直腸真桿菌(E.rectale)，以及腸道益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳酸菌(Lactobacillis)，分析腸道菌群、SCFAs和炎性因子與PD的關(guān)系，探討PD發(fā)病及進(jìn)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年4月至2019年4月入住我院神經(jīng)內(nèi)科的PD病人，同時(shí)選取同一時(shí)間段我院年齡、性別與之相匹配的健康體檢者作為對(duì)照組。PD組25例，男12例，女13例，年齡60～80歲，平均(68.34±6.15)歲。對(duì)照組25例，男15例，女10例，年齡60～80歲，平均(69.89±7.33)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PD由?？漆t(yī)生進(jìn)行確診，嚴(yán)格按照帕金森病協(xié)會(huì)PD診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)年齡≥60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近3個(gè)月內(nèi)服用抗生素和微生態(tài)制劑；(2)近1年發(fā)生過非創(chuàng)傷性感染、過敏、免疫異常疾??；(3)有手術(shù)及其他應(yīng)急情況人群；(4)排便習(xí)慣異常；(5)有明顯肝、腎功能損害，慢性腸胃功能紊亂，有腹瀉、膽道感染病史和腸炎等胃腸道疾病[10]。所有研究對(duì)象知情同意，并進(jìn)行帕金森綜合評(píng)分量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS)評(píng)估。UPDRS包括精神、行為和情緒，日?；顒?dòng)，運(yùn)動(dòng)功能，治療的并發(fā)癥4個(gè)方面，分值越高，PD病人病情越嚴(yán)重。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x(Bio-rad IQ5，美國)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)，凝膠成像儀(Bio-rad，美國)，糞便細(xì)菌DNA提取試劑盒(凱杰，德國)，TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司，貨號(hào)：YBC102g；YBA079Ov01；YBA056Bo01)。所用引物如表1所示，所有引物由上海生工合成。

表1 16S rDNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR定量腸道菌群引物

1.3 糞樣采集及腸道菌群定量 收集2組研究人群早起空腹中段糞便，裝入無菌的糞樣收集管中，并標(biāo)記日期、分組和姓名，置于液氮罐中后，裝入-80 ℃冰箱保存。將收集的糞樣進(jìn)行16S rDNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR定量檢測(cè)，檢測(cè)腸道菌群包括F.prausnitzii、E.rectale、Bifidobacterium、Lactobacillis，檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[10]。采用糞樣細(xì)菌DNA提取試劑盒提取糞樣細(xì)菌總DNA，吸取2μL作為擴(kuò)增樣本，分別加入各目標(biāo)細(xì)菌引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收各細(xì)菌電泳條帶作為陽性模板，采用絕對(duì)定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各目標(biāo)腸道細(xì)菌的拷貝數(shù)，使用Log(copies)表示。

1.4 SCFAs測(cè)定 精密稱取采集的早起空腹中段糞樣0.3 g，進(jìn)行預(yù)處理，配置乙酸、丙酸和正丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，采用火焰離子化檢測(cè)器，以氮?dú)鉃檩d氣，手動(dòng)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為1μL，運(yùn)行18 min，通過與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比定性，以峰面積定量計(jì)算糞樣乙酸、丙酸和正丁酸水平，具體步驟參考文獻(xiàn)[13]。

1.5 血樣采集及炎性因子測(cè)定 收集2組研究對(duì)象早起空腹靜脈血，離心后，嚴(yán)格按照TNF-α、IL-6和IL-10試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 2組UPDRS比較 與對(duì)照組相比，PD組病人UPDRS總得分明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 2組腸道菌群比較 16S rDNA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PD組病人腸道E.rectale、F.prausnitzii和Lactobacillis水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組Bifidobacterium水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組人群UPDRS評(píng)分及腸道菌群比較

2.3 2組腸道SCFAs及血清炎癥因子水平比較 與對(duì)照組相比，PD組病人腸道丙酸、丁酸水平明顯降低，血清TNF-α、IL-6水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組人群腸道SCFAs和血清炎癥指標(biāo)比較

2.4 UPDRS與腸道菌群、SCFAs及血清炎性因子水平的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示， UPDRS總得分與PD病人腸道E.rectale、F.prausnitzii、丙酸和丁酸水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與血漿TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 UPDRS與腸道菌群、SCFAs及炎性因子的相關(guān)性(r)

3 討論

PD是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一。ENS通過迷走神經(jīng)與大腦雙向通信，因此迷走神經(jīng)是腦-腸軸的重要連接部分。腸道中微生物群組可以在腦-腸軸上發(fā)揮重要作用，通過影響ENS和CNS的神經(jīng)元功能來發(fā)揮作用，成為胃腸道與CNS之間的雙向交流系統(tǒng)。腸道菌群組和微生物代謝產(chǎn)物可參與新陳代謝并影響宿主健康，尤其在認(rèn)知、行為和免疫方面。

研究表明，PD病人和健康對(duì)照者之間糞便微生物群的結(jié)構(gòu)和豐度有所不同：與健康對(duì)照組相比，PD組糞樣中布勞特氏菌(Blautia)、類桿菌(Faecalibacterium)和胃球菌(Ruminococcus)屬水平顯著降低；而腸賀氏菌(Escherichia-Shigella)、鏈球菌(Streptococcus)、變形桿菌(Proteus)和腸球菌(Enterococcus)屬水平顯著升高[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PD組腸道F.prausnitzii水平明顯降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;另還發(fā)現(xiàn)PD組人群腸道E.rectale、Lactobacillis水平明顯降低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)UPDRS總得分與PD人群腸道E.rectale和F.prausnitzii水平呈負(fù)相關(guān)，從而驗(yàn)證了腸道菌群與PD之間存在相關(guān)性。F.prausnitzii和E.rectale屬于產(chǎn)丁酸菌，是結(jié)腸中兩大優(yōu)勢(shì)菌類，分別屬于梭菌簇IV和梭菌簇XIVa。與對(duì)照組相比，PD病人腸道中產(chǎn)生抑制炎癥丁酸鹽的Blautia、糞球菌(Coprococcus)、羅氏菌(Roseburia)和Faecalibacterium屬水平明顯減少，而具有促進(jìn)炎癥的勞爾氏菌(Ralstonia)屬水平明顯升高[3]。腸道細(xì)菌可通過其合成神經(jīng)遞質(zhì)和產(chǎn)生具有神經(jīng)活性的代謝產(chǎn)物(如SCFAs)來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)活化的能力，影響CNS[16]。PD除與某些腸道菌群豐度密切相關(guān)，還與糞便SCFAs水平減少密切相關(guān)。SCFAs的降低可能會(huì)引起ENS的改變，并導(dǎo)致PD病人的胃腸動(dòng)力異常，加劇PD的病情進(jìn)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PD組病人腸道丙酸和丁酸水平顯著降低。

SCFAs水平降低會(huì)損害腸道上皮屏障，從而使ENS更易受腔內(nèi)病原體的侵害，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。SCFAs已被認(rèn)為是腸道微生物群對(duì)腸道免疫功能影響的潛在介質(zhì)。大量證據(jù)證實(shí)了神經(jīng)炎癥在PD病理中的作用，諸如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)和細(xì)胞因子等炎性成分與CNS的神經(jīng)炎癥有關(guān)。研究表明，與對(duì)照組相比，PD組炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)增加[18]，與本文研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)UPDRS總得分與PD病人血漿TNF-α和IL-6水平呈正相關(guān)，說明TNF-α和IL-6可能參與PD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究推測(cè)PD病人出現(xiàn)胃腸道早期癥狀時(shí)，腸道菌群結(jié)構(gòu)組成已發(fā)生變化，導(dǎo)致產(chǎn)SCFAs細(xì)菌水平降低，從而導(dǎo)致腸道SCFAs水平降低，增加體內(nèi)炎癥反應(yīng)，并通過腦-腸軸影響CNS，加劇PD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。但該作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行研究驗(yàn)證。