＊姬麗娟 李倩 李漢超 郝志明

（西安交通大學(xué) 陜西 710000）

引言

實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR），PCR聚合酶聯(lián)反應(yīng)是體外選擇性擴(kuò)增特定基因片段技術(shù)，被廣泛應(yīng)用臨床基因診斷、食品安全、環(huán)境污染檢測，該項(xiàng)技術(shù)能夠準(zhǔn)確的獲取基因片段，且特異性、靈敏度高，是目前檢測核酸拷貝數(shù)的可靠方法之一。

1.Taq DNA聚合酶的制備

(1)Taq-DNA聚合酶的表達(dá)

取pTaq質(zhì)粒lμL與感受態(tài)大腸桿菌E coli DH5a菌株進(jìn)行混合，冰浴30min，42℃水浴90s，然后冰浴5min，進(jìn)行質(zhì)粒的熱休克。加入500μL不含氨芐青霉索（Amp）的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2h。取100μL培養(yǎng)液均勻涂布在含有100μg/mL氨芐青霉（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，挑選陽性重組克隆。轉(zhuǎn)接于Amp濃度為100μg/mL的5mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、180r／min培養(yǎng)2h（OD600=0.4）后，加入100μL IPTG（1mol/L），37℃180r/min振蕩培養(yǎng)6h，誘導(dǎo)Taq-DNA聚合酶基因的表達(dá)。

(2)Taq DNA聚合酶的提取和純化

3500rpm離心10分鐘收集菌體，按10:1體積加入重懸液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L DTT，10%甘油）重懸沉淀，具體純化過程參考文獻(xiàn)劉欽松重組Taq DNA聚合酶的表達(dá)和純化鑒定。

(3)重組Taq DNA聚合酶的活性測定

PCR反應(yīng)體系總體積為20μL，反應(yīng)組成為：商品化的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，模板pAAV-LacZ 0.5μL，MgCl2（20mmol/L）2μL，d NTP（2.5mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（0.1μL，0.5μL，1μL，2μL），滅菌ddH2O補(bǔ)足20μL。即用不同濃度純化的Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，以市售商品化的Taq DNA聚合酶（天根）1U為對照。通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的亮度估算純化的酶活性及用量，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增。

根據(jù)引物CMV（正向引物F：5'-GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3'反向引物R：5'-CAATGGGGCGGAGTTGTT-3'）確定擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，55℃退火30s，30個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳儀進(jìn)行檢測產(chǎn)物質(zhì)量。

2.實(shí)時(shí)定量PCR mix的配置及條件優(yōu)化

(1)配置實(shí)時(shí)定量PCR mix

參照EvaGreen染料說明書以及文獻(xiàn)配方，自制的10×PCR buffer配置方法如下：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100。

在總體積為20μL的PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)組成如下：自制的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，pAAV-LacZ 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL（根據(jù)1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得），EvaGreen1μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足20μL。以商品化10×real-time PCR mix做對照，反應(yīng)體積及反應(yīng)組成同上。引物及擴(kuò)增反應(yīng)程序同1.3。循環(huán)結(jié)束后4℃保存。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2)自制實(shí)時(shí)定量PCR試劑的優(yōu)化

在現(xiàn)有的反應(yīng)體系中，我們嘗試分別加入二甲基亞砜（DMSO）、甘油、甲酰胺、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）等對PCR反應(yīng)體系有增強(qiáng)作用的試劑，觀察對real-time PCR結(jié)果有無影響。具體用量：DMSO 5%；甘油10%；甲酰胺5%；海藻糖0.1mol/L；BSA：50mg/L；余條件同2.1。并將起始濃度為1.2×1012copies/mL的AAV-LacZ質(zhì)粒模版進(jìn)行10倍稀釋，連續(xù)7個(gè)梯度，觀察自制試劑與商品化試劑的差異。

3.自制實(shí)時(shí)定量PCR mix的穩(wěn)定性驗(yàn)證

將配置的自制實(shí)時(shí)定量PCR mix 1mL在-80℃下反復(fù)凍融，每次凍融后取樣100μL于4℃保存，用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。待凍融7次之后，以pAAV-LacZ為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，收集熒光信號(hào)，觀察Ct值變化。

(1)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集，PCR反應(yīng)效率，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等均應(yīng)用（數(shù)據(jù)分析軟件PCR分析儀電泳儀）。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

原核表達(dá)純化的Taq DNA聚合酶純度較高，與商品化的Taq DNA聚合酶活性接近。

4.自制real-time PCR mix的條件優(yōu)化

（1）自制的PCR mix與市售的mix對比，結(jié)果顯示：自制的實(shí)時(shí)定量PCR試劑與商品化試劑擴(kuò)增曲線接近，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示qPCR擴(kuò)增條帶單一清晰。

（2）PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑對qPCR影響。在現(xiàn)有的PCR mix中分別加入DMSO、甘油、甲酰胺、海藻糖、BSA等文獻(xiàn)中報(bào)道對PCR反應(yīng)體系有增強(qiáng)作用試劑，加入甘油和BSA的PCR反應(yīng)體系qPCR的Ct值與不加反應(yīng)增強(qiáng)劑的接近，加DMSO，海藻糖的PCR體系Ct值均大于不加任何增強(qiáng)劑的Ct值，而加入甲酰胺后無Ct值。因此，下一步優(yōu)化甘油和BSA的使用濃度。

甘油5%、10%，BSA 50mg/L、100mg/L兩個(gè)梯度，兩種單獨(dú)或者組合搭配，行qPCR觀察擴(kuò)增效率?？梢娛褂?%甘油+100mg/L BSA時(shí)，qPCR的Ct值最小。因此，最終選擇5%丙三醇+100mg/L BSA。

（3）優(yōu)化后qPCR mix與市售商品化qPCR mix的擴(kuò)增效率比較。優(yōu)化后real-time PCR mix組成：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5%Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。

在相同反應(yīng)參數(shù)、反應(yīng)體系下，倍比稀釋模板（1012，1011，1010，109，108，107，106，105），觀察自制qPCR擴(kuò)增曲線及Ct值與市售羅氏和Gene Star qPCR mix差異。自制qPCR的擴(kuò)增曲線良好，Ct值隨模版濃度的降低逐漸增大，與羅氏和Gene Star qPCR mix無明顯差異。

（4）自制10×qPCR mix的穩(wěn)定性檢測。將自制10×qPCR mix反復(fù)凍融后行qPCR，經(jīng)反復(fù)凍融后，qPCR擴(kuò)增曲線及Ct值均無明顯變化。

5.結(jié)論與討論

據(jù)目前所了解市售商品化real-time PCR mix大多采用SYBR Green I作為其熒光染料，SYBR Green I是利用插入雙鏈DNA小溝中發(fā)光的特性監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物增加，使用簡便易行、成本較低，但特異性相對較差，同時(shí)對PCR反應(yīng)有一定的抑制作用，染料濃度以及染料與反應(yīng)體系組成需要繁瑣嚴(yán)格的優(yōu)化。而EvaGreen是常用于高分辨率溶解曲線分析的飽和DNA雙鏈熒光染料，熒光信號(hào)強(qiáng)，不抑制PCR反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)直接采用EvaGreen作為熒光染料進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

各種PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑作用機(jī)理不同，DMSO主要用于高GC含量的模板擴(kuò)增，可能的機(jī)理是改善CG含量高的DNA變形情況，降低其二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得聚合酶在二級(jí)結(jié)構(gòu)處延伸，一般超過體積的10%會(huì)影響其保真性；甘油：保護(hù)Taq酶，增加酶的穩(wěn)定性，以提高產(chǎn)量；甲酰胺：促進(jìn)引物-模板退火，降低帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA的變性溫度；海藻糖亦主要用于高GC含量模板的擴(kuò)增；BSA是某些酶的穩(wěn)定劑，還能防止酶蛋白在玻璃器皿表面的附著。而在本實(shí)驗(yàn)中，甲酰胺，海藻糖，DMSO均不同程度的影響了qPCR的反應(yīng)效率，可能與其用量及試劑本身的純度有關(guān)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)中，原核表達(dá)純化Taq DNA聚合酶具有較高的純度，0.1μL的自制酶活性與1U市售Taq DNA聚合酶相當(dāng)。以此酶自制10×qPCR mix：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。該試劑擴(kuò)增效率與市售商品化qPCR mix無差異，易保存，穩(wěn)定性良好且價(jià)格便宜，可廣泛應(yīng)用于核酸定量檢測。