孫岑岑 梅汝煥 鄭 燕 方 瑜 于曉云 厲旭云 王夢令 高鈴鈴

浙江大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心，浙江省杭州市 310058

蟾蜍的基本生命活動和生理功能與溫血動物近似，其離體組織和器官所需的生活條件較為簡單，常用于神經(jīng)生理、肌肉生理、心臟生理等實驗[1]。在高等醫(yī)學院校實驗教程中采用雙毀髓法處理蟾蜍，是給予實驗蟾蜍手術(shù)疼痛處理方法的唯一動物福利[1]；該方法在學生實驗中，由于枕骨大孔刺入位置不準、插入過深過淺等原因，往往不能及時順利完成毀腦脊髓工作，給蟾蜍帶來長時間的巨大痛苦，抑或操作不當，發(fā)生蟾汁噴射到操作者眼睛等安全事件。其實，兩棲類動物實驗研究中的毀腦脊髓法，在國外普遍已被麻醉劑法取代，不少學者呼吁放棄使用毀腦脊髓法、淋巴囊注射法或冷凍法用于兩棲動物的制動處理，以最大限度減輕對實驗動物的傷害[2-3]。然而，由于毀腦脊髓法對心臟和神經(jīng)—腓腸肌損傷最小，且尚未找到合適的替代方法(對心臟和腓腸肌標本無影響，且最大限度地降低對實驗動物的損傷)，雙毀髓法仍是國內(nèi)尤其是教學實驗中最普遍使用的方法。亦有研究報道可用淋巴囊注射烏拉坦麻醉法替代毀腦脊髓法用于蟾蜍心臟實驗[4]，但淋巴囊注射對于實驗技術(shù)要求更高，不易掌握，不適合在教學實驗中運用。因此，為了更加科學、合理、人道地使用實驗動物，探索新的蟾蜍制動方法以取代教學實驗中的毀腦脊髓法具有重要意義。

蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌興奮與收縮實驗和離體心臟實驗是最為常見和經(jīng)典的生理教學實驗，對于學生深入認識和理解神經(jīng)肌肉興奮收縮和心肌收縮調(diào)控的基本生理學知識具有重要意義[1]。為此，本研究選擇上述兩個蟾蜍實驗作為研究背景，選用多種麻醉劑處理蟾蜍，檢測各麻醉劑對蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌和心肌的影響，以篩選最佳替代毀腦脊髓的方法，從而最大限度減少實驗過程對動物機體的損傷，減輕動物遭受的痛苦和應激反應，并獲得客觀、科學的實驗研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 (1)實驗動物：健康中華蟾蜍指名亞種(Bufo gargarizans gargarizans Cantor，Zhoushan Toad)，雌雄不均，由浙江大學動物實驗中心提供。實驗過程中所有的操作均符合動物福利的要求。(2)實驗試劑：異丙酚，分析純，購于力邦制藥，批號H20010368；戊巴比妥鈉，分析純，購于sigma，貨號 P3761；氨基甲酸乙酯，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司，貨號3019228；MS-222，分析純，購于Adamas，貨號88345。(3)實驗儀器：張力換能器(成都儀器廠)，RM6240BD型生物信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)等。

1.2 實驗方法 (1)實驗動物的分組與處理：將蟾蜍[中華蟾蜍指名亞種，(120±15)g]按體重和性別平均分到五組，分別為毀腦脊髓組(采用傳統(tǒng)的毀腦脊髓的方法處理蟾蜍)；異丙酚組(濃度10g/L, 1ml/100g進行腹腔麻醉)；戊巴比妥鈉組(濃度2%，0.4ml/100g進行腹腔麻醉)；氨基甲酸乙酯組(濃度10%，2ml/100g進行腹腔麻醉)；MS-222組[1g/L MS-222溶液(NaHCO3調(diào)至pH 7.2～7.4)中浸泡10～15min即可麻醉][2,5]。(2)在體蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌興奮收縮實驗：采用不同方法制動處理的蟾蜍，分離坐骨神經(jīng)和腓腸肌，利用RM6240對腓腸肌收縮的各項指標進行測定。①閾強度：前負荷2.5g，波寬0.1ms，波間隔1 000ms,測定不同刺激強度下的收縮張力；②最適前負荷：最大刺激強度為本次實驗的刺激強度，波寬0.1ms，波間隔1 000ms，測定不同前負荷下的收縮張力；③最適波間隔的測定:最大刺激強度和最適前負荷作為本次實驗的刺激強度和前負荷，波寬0.1ms，脈沖數(shù)2個，測定不同波間隔下的收縮張力；④最適肌肉持續(xù)興奮時間：最大刺激強度、最適前負荷和最適波間隔作為實驗刺激參數(shù)，波寬0.1ms，測定不同脈沖數(shù)時的收縮張力。(3)蟾蜍離體心臟實驗：采用不同方法制動處理的蟾蜍，分離制備蛙心標本并進行蛙心插管，與張力換能器連接。①不同麻醉劑對蛙心搏動的影響：向插管中加入1ml任氏液，心搏曲線穩(wěn)定后記錄正常的心搏曲線45s，并測定蛙心最大收縮壓(EST)、最大舒張壓(EDT)、心率(HR)。②不同藥物對蛙心搏動的影響：向灌流液(1ml)中加入不同藥物(0.5% CaCl2溶液25μl、1.5% KCl溶液20μl、6×10-6mol/L乙酰膽堿15μl、腎上腺素溶液10μl), 心搏曲線穩(wěn)定后記錄45s數(shù)據(jù)。每次實驗后均用任氏液反復沖洗以去除藥物殘留。

1.3 評價指標 骨骼肌收縮張力的大小與前負荷、刺激強度、刺激時間、刺激頻率等有關(guān)，刺激參數(shù)不同，骨骼肌的收縮張力也不同。故分別選擇閾刺激強度，最大刺激強度、最適前負荷、最適波間隔、最適興奮持續(xù)時間及其相應的收縮力作為評價指標，對坐骨神經(jīng)—腓腸肌的興奮收縮性能進行多方面的評估。心臟的興奮收縮性能可通過最大收縮壓(EST)、最大舒張壓(EDT)、心率(HR)進行評價，細胞外液的鈉、鉀及鈣等離子對心肌細胞的自律性、興奮性、傳導性和收縮性產(chǎn)生影響。故選擇EST、EDT和HR作為評價指標，對不同麻醉制動處理的離體心臟及其藥物處理前后的興奮收縮性能進行測定，比較并評價不同麻醉劑對心臟的影響。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有的實驗重復至少3次。實驗數(shù)據(jù)使用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以平均值±標準差表示，顯著性差異通過two-tailed Student’st-test進行分析計算。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同麻醉劑對腓腸肌收縮張力的影響 分別用戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯、異丙酚和MS-222對蟾蜍進行麻醉處理，毀腦脊髓組作為對照，檢測不同麻醉劑對坐骨神經(jīng)—腓腸肌興奮與收縮的影響。結(jié)果顯示，在2.5g前負荷、0.1ms波寬單刺激條件下，各麻醉組樣本的最大刺激強度均與毀腦脊髓組無明顯區(qū)別，但MS-222、戊巴比妥鈉組腓腸肌閾刺激強度顯著高于毀腦脊髓組，而最大收縮張力明顯低于毀腦脊髓組；氨基甲酸乙酯組腓腸肌的閾強度與毀腦脊髓組比無顯著性差異，但最大收縮張力明顯低于毀腦脊髓組；而異丙酚組腓腸肌的各項指標(閾強度、最大刺激強度及收縮張力)均與毀腦脊髓組無顯著性差異(P>0.05)。見表1、圖1A～B。故選擇異丙酚麻醉組進行后續(xù)的神經(jīng)—腓腸肌研究。見圖1。

表1 不同麻醉劑制動處理的坐骨神經(jīng)—腓腸肌的閾刺激和最大刺激強度及相應的收縮張力

2.2 異丙酚對腓腸肌收縮的影響 用異丙酚對蟾蜍進行麻醉處理，對不同刺激條件下的腓腸肌收縮張力進行測定。結(jié)果顯示，異丙酚麻醉組和毀腦脊髓對照組的腓腸肌收縮變化趨勢均一致，無明顯差異(P>0.05)。二者的最適前負荷、最適波間隔及最適興奮持續(xù)時間均無顯著性差異(P>0.05)。見圖1C～E。同時，在最適前負荷、最適波間隔、最適肌肉持續(xù)興奮時間、最大刺激強度的電刺激作用下，異丙酚組的腓腸肌達到最大收縮張力為(335.99±40.52)g，與對照組的(348.11±36.17)g比較無顯著性差異，(P>0.05)。見圖1E。

圖1 不同麻醉劑對蟾蜍神經(jīng)—腓腸肌的影響

2.3 麻醉劑對蟾蜍離體心臟搏動的影響 分別用戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯、異丙酚和MS-222對蟾蜍進行麻醉處理，毀腦脊髓組作為對照，檢測不同麻醉劑對蟾蜍離體心臟搏動的影響。

與毀腦脊髓組相比，戊巴比妥鈉、氨基甲酸乙酯麻醉處理的蟾蜍，其心臟的EST、EDT和 HR均有顯著性降低，且氨基甲酸乙酯處理的蟾蜍其心臟搏動曲線出現(xiàn)明顯波動異常，而異丙酚麻醉的蟾蜍其離體心臟的EST和EDT與對照組無顯著性差異，但HR明顯降低，說明上述三種麻醉劑對蛙心搏動均有不同程度的影響(圖2、圖3A～C)。而MS-222浸泡法處理的蟾蜍，其離體心臟的EST、EDT和HR與對照組均無明顯差異(P>0.05)。說明MS-222對蛙心的搏動無明顯影響，故選擇MS-222浸泡麻醉組進行后續(xù)研究(圖2、圖3A～C)。

圖2 不同麻醉劑處理的蟾蜍離體心臟的心搏曲線

2.4 MS-222對藥物處理的蛙心搏動的影響 選擇MS-222浸泡處理的蟾蜍作為實驗組，毀腦脊髓處理的蟾蜍作為對照組，分離蛙心，分別記錄CaCl2、KCl、乙酰膽堿和腎上腺素處理前后蛙心的EST、EDT和HR的變化情況。結(jié)果如圖3所示，MS-222實驗組和對照組的蛙心的EST、EDT和HR變化趨勢均完全一致，無明顯差異(P>0.05)。見圖3D～F。

圖3 不同麻醉劑對蟾蜍離體心臟的影響

3 討論

不同麻醉劑對不同的組織、系統(tǒng)等影響不同[6-12]，且麻醉劑腹腔麻醉后對蟾蜍坐骨神經(jīng)—骨骼肌和離體心臟是否受到影響或影響程度大小尚無報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，戊巴比妥鈉和氨基甲酸乙酯麻醉處理的蟾蜍，其腓腸肌和心臟收縮均受到明顯抑制，說明兩種麻醉劑均不適合作為神經(jīng)—腓腸肌和蛙心實驗的制動方法。

異丙酚是目前最新的靜脈麻醉藥，已被廣泛應用于臨床麻醉和ICU鎮(zhèn)靜。已有文獻報道異丙酚可顯著抑制大鼠心肌收縮[13]，但其對蟾蜍骨骼肌和心臟的影響尚無研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚麻醉法對蟾蜍心臟搏動有影響，但用異丙酚麻醉的蟾蜍其腓腸肌收縮的各項指標及變化趨勢均與毀腦脊髓組無顯著性差異，說明異丙酚對坐骨神經(jīng)—腓腸肌的興奮與收縮無影響或影響不明顯。故異丙酚可作為替代法用于神經(jīng)—腓腸肌實驗中的蟾蜍制動處理。

MS-222，(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate)，俗稱魚安定等，是美國FDA批準的唯一活魚運輸麻醉劑[14]。MS-222還用于各種水產(chǎn)品的實驗室研究領(lǐng)域，已被用于多種實驗用魚或兩棲動物的麻醉[2,5,15-16]。但該麻醉劑用于中華蟾蜍的研究鮮有報道，同時MS-222對神經(jīng)—腓腸肌和離體心臟的影響更無研究。本研究發(fā)現(xiàn)，1% 的MS-222浸泡處理的蟾蜍，其腓腸肌收縮力明顯減弱，但心臟搏動(EST、EDT、HR)與毀腦脊髓處理組無顯著性差異，說明MS-222對心臟沒有影響或影響極小，故MS-222可作為蟾蜍心臟實驗的麻醉劑。

用MS-222浸泡法和異丙酚腹腔注射法處理蟾蜍，有以下幾個優(yōu)勢：(1)人道主義，善待動物，該方法可最大限度地減少實驗動物——蟾蜍的痛苦，異丙酚麻醉后的蟾蜍5min之內(nèi)即可進入麻醉狀態(tài)，用1% MS-222浸泡處理的蟾蜍10～15min即可麻醉；(2)操作簡單，在實驗教學中，學生更易掌握，保證實驗的順利進行；(3)安全角度，該方法可最大限度地避免和減少由于操作不當而造成的意外，保證學生的人身安全；(4)增強學生動物福利方面的意識，加強動物倫理方面的教育，有助于學生醫(yī)德的培養(yǎng)。

總之，本研究以醫(yī)學教學實驗中常用的實驗動物蟾蜍為研究對象，首次就多種麻醉劑在經(jīng)典生理實驗——神經(jīng)—腓腸肌興奮收縮實驗和離體蛙心實驗中的影響進行充分探討，首次確定了異丙酚腹腔麻醉和MS-222浸泡麻醉法分別對神經(jīng)—腓腸肌和心臟不產(chǎn)生明顯影響，并首次確定了二者可作為神經(jīng)—腓腸肌實驗和心臟實驗的毀腦脊髓固定法的替代方法，該方法簡單易行，對操作技術(shù)要求低，同時避免對蟾蜍的過度傷害，可廣泛用于今后的教學和科研實驗。