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(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.林木果樹(shù)研究所;b.上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201403)
‘鳳丹’Paeonia ostii為原產(chǎn)我國(guó)的芍藥屬名貴花卉,栽培歷史悠久,集觀賞和藥用價(jià)值于一身,素有“花中王后”的美譽(yù)?!P丹’籽油分含量高,可食用,因富含亞麻酸等對(duì)人體健康有益的不飽和脂肪酸,具增強(qiáng)人體免疫力和延緩衰老等保健功能[1]。目前,我國(guó)牡丹產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展,對(duì)于新優(yōu)品種的需求與日俱增,然而牡丹育種技術(shù)單一落后,多采用傳統(tǒng)雜交育種,無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。利用先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因、基因編輯技術(shù)進(jìn)行新優(yōu)品種選育是牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向,而這些技術(shù)的應(yīng)用均依賴于高效誘導(dǎo)與再生體系的建立。
高等植物再生主要包括組織修復(fù)(tissue repair)、器官發(fā)生(organogenesis)和體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis)[2]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生一般是指在未經(jīng)生殖細(xì)胞融合的情況下植物體細(xì)胞模擬合子胚胎發(fā)生發(fā)育形成完整新個(gè)體的過(guò)程,是誘導(dǎo)植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)全能性的一種形式。20 世紀(jì)90年代,Sangwan 等[3]和Wu 等[4]報(bào)道了以擬南芥未成熟合子胚作為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織,進(jìn)而誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。之后,在較多木本植物中也成功誘導(dǎo)了體細(xì)胞胚胎發(fā)生。在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)過(guò)程中,植物激素起非常重要的作用,通常用生長(zhǎng)素類似物(如2,4-D)等處理后,可觀察到愈傷組織和胚性細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)生[5]。近年來(lái),毒莠定(Picloram,PIC)、麥草畏(Dicamber,DIC)等生長(zhǎng)素類除草劑也被用于植物體細(xì)胞胚再生的相關(guān)研究中,并取得較好的效果。國(guó)內(nèi)外關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)及再生相關(guān)研究已有報(bào)道,主要涉及快繁體系的建立和優(yōu)化[6-9],以合子胚為外植體的愈傷組織再生技術(shù)體系的建立[10],以鱗芽為外植體建立快繁體系[11],誘導(dǎo)外植體愈傷組織[12-16],通過(guò)莖尖培養(yǎng)獲得再生苗[17],減輕牡丹愈傷褐化現(xiàn)象發(fā)生[18-19],促進(jìn)生根[20]等方面。關(guān)于牡丹體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的研究報(bào)道相對(duì)較少。殷麗青等[21]以牡丹品種‘鳳丹’的不同外植體為材料,研究了不同濃度PIC 對(duì)愈傷組織及體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響,并建立了牡丹高頻體細(xì)胞胚發(fā)生體系,但獲得的再生植株較少。朱向濤等[22]建立了‘鳳丹’的體胚誘導(dǎo)技術(shù)體系,但誘導(dǎo)率僅38.33%。秦磊等[23]開(kāi)展了牡丹‘Golden era’愈傷組織發(fā)生和分生結(jié)節(jié)形成的細(xì)胞組織學(xué)研究。雖然關(guān)于牡丹組織培養(yǎng)再生體系已有一定的研究基礎(chǔ),但是仍存在愈傷分化率低、極易褐化、生根困難等難題,再生效率和生根率等有待提高,而且目前完整的再生體系成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?!P丹白’為江南牡丹群‘鳳丹’的系列品種之一,本研究中以‘鳳丹白’成熟的合子胚為試驗(yàn)材料,通過(guò)摸索適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度,建立愈傷組織誘導(dǎo)及增殖技術(shù)體系,并對(duì)不同狀態(tài)的愈傷組織開(kāi)展形態(tài)學(xué)和組織細(xì)胞學(xué)鑒定,確定具分化潛能的胚性愈傷組織,旨在為牡丹再生技術(shù)體系的建立提供參考。
單瓣白花‘鳳丹白’成熟種子由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究所提供。
1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
選取健康飽滿的‘鳳丹白’成熟種子,用洗滌劑清洗表面,流水沖洗30 min,無(wú)菌水中浸泡2 ~3 d 后進(jìn)行消毒。在無(wú)菌環(huán)境下先將種子用70%的酒精浸泡30 ~60 s,再用10%的次氯酸鈉表面消毒30 min,無(wú)菌水沖洗6 次,無(wú)菌濾紙吸干備用。用手術(shù)刀切開(kāi)種子,剝?nèi)〕墒炫呓臃N于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
在改良MS 培養(yǎng)基(按WPM 培養(yǎng)基添加硝酸鈣)中添加0.5 g/L 水解酪蛋白(購(gòu)自上海宇涵生物技術(shù)公司)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。其中,生長(zhǎng)素類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括PIC、DIC、2,4-D、NAA,細(xì)胞分裂素類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括6-BA、TDZ、KT,均購(gòu)自Sigma 公司,各處理中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度配比見(jiàn)表1。用NaOH 將培養(yǎng)基pH 調(diào)為5.8±0.1,121 ℃滅菌20 min。每個(gè)處理接種3 瓶,每瓶接種10 個(gè)外植體,每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,黑暗條件下培養(yǎng),并觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況,30 d后統(tǒng)計(jì)成活率和愈傷組織誘導(dǎo)率。
表1 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其質(zhì)量濃度Table 1 Types and concentrations of plant growth regulators used in callus induction medium of P.ostii cv.‘Phoenix White’ mg/L
1.2.2 愈傷組織增殖培養(yǎng)
將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)的愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養(yǎng)基中。除添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑外,愈傷組織增殖基本培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分基本相同。其中,添加的生長(zhǎng)素類包括PIC、DIC、NAA,添加的細(xì)胞分裂素類包括6-BA、TDZ、KT,均購(gòu)自Sigma 公司。各處理中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度配比見(jiàn)表2。每處理接種3 瓶,每瓶接種10 個(gè)外植體,每個(gè)處理重復(fù)3 次。培養(yǎng)溫度為(25±2)℃,黑暗條件下培養(yǎng),并觀察愈傷組織增殖情況,30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織擴(kuò)增率和擴(kuò)增系數(shù)。
表2 ‘鳳丹白’愈傷組織增殖培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其質(zhì)量濃度Table 2 Types and concentrations of plant growth regulators used in callus proliferation of P.ostii cv.‘Phoenix White’ mg/L
1.2.3 愈傷組織分類和鑒定
根據(jù)繼代培養(yǎng)后愈傷組織的生長(zhǎng)情況、顏色、質(zhì)地、形態(tài)、分散程度等對(duì)愈傷組織進(jìn)行分類。將分割成小塊的不同狀態(tài)的愈傷組織置于體視顯微鏡(Nikon SMZ 745T)下觀察拍照,參照文獻(xiàn)[24]中的方法制作常規(guī)石蠟切片,并在光學(xué)顯微鏡(Nikon ECLIPSE E200)下采集圖像信息。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征與石蠟切片鑒定是否為胚性愈傷組織,并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率等指標(biāo)。
外植體成活率為成活的外植體數(shù)占接種外植體數(shù)的百分比;愈傷誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)占成活外植體數(shù)的百分比;愈傷擴(kuò)增率為擴(kuò)增愈傷數(shù)占接種愈傷數(shù)的百分比;愈傷擴(kuò)增系數(shù)為培養(yǎng)30 d 后外植體質(zhì)量較其初始質(zhì)量的增加值占外植體初始質(zhì)量的百分比。
使用SPSS 16.0 軟件采用單因素方差分析法(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
將成熟胚接種于培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后膨大,培養(yǎng)5 d后子葉邊緣膨松(圖1A),培養(yǎng)9 d 后子葉邊緣出現(xiàn)裂縫(圖1B),培養(yǎng)14 d 后部分子葉邊緣膨大形成愈傷組織(圖1C),培養(yǎng)21 d 后2 片子葉均膨大形成愈傷組織(圖1D),培養(yǎng)30 d 后子葉基部膨大形成愈傷組織(圖1E)。部分外植體子葉邊緣膨大為白色球狀,后期不能繼續(xù)發(fā)育(圖1F)。
圖1 ‘鳳丹白’成熟胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的狀態(tài)Fig.1 The status of mature embryo of P.ostii cv.‘Phoenix White’ on callus induction medium
誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比對(duì)種胚的愈傷誘導(dǎo)影響較大,各培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)情況見(jiàn)表3。由表3可知,在14種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)基中外植體成活率最高,為93.33%;添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 的培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率最高,為70.61%;添加4 mg/L 2,4-D的培養(yǎng)基中外植體成活率和愈傷組織誘導(dǎo)率均最低,且均為21.88%。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PIC、DIC、2,4-D 均能促進(jìn)外植體愈傷組織的誘導(dǎo),但添加PIC 和DIC 的促進(jìn)效果明顯好于添加2,4-D。除了生長(zhǎng)素類物質(zhì)外,培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素對(duì)愈傷組織的狀態(tài)有影響,在添加相同質(zhì)量濃度PIC 的培養(yǎng)基上,添加TDZ 的效果優(yōu)于添加6-BA,極顯著優(yōu)于添加NAA 和KT。
表3 不同培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)情況?Table 3 The effect of plant growth regulators on callus inductivity of P.ostii cv.‘Phoenix White’ %
在添加不同配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上,‘鳳丹白’胚性愈傷組織的增殖情況見(jiàn)表4。由表4可知,添加6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中愈傷擴(kuò)增率最高,為97.78%,愈傷擴(kuò)增系數(shù)最高,為19.97。
表4 不同培養(yǎng)基中‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織增殖情況Table 4 The effect of plant growth regulators on callus differentiation of P.ostii cv.‘Phoenix White’
在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加0.2 或0.4 mg/L PIC 時(shí),愈傷擴(kuò)增率分別為55.78%、48.97%,且長(zhǎng)期培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L DIC時(shí),愈傷擴(kuò)增率為87.78%,長(zhǎng)期培養(yǎng)后會(huì)出現(xiàn)褐化死亡。結(jié)果表明,高質(zhì)量濃度的PIC 與低質(zhì)量濃度的NAA 或6-BA 配合使用,利于愈傷組織增殖生長(zhǎng),愈傷組織胚性保持較好;培養(yǎng)基中添加低質(zhì)量濃度的NAA、KT、PIC 和DIC,也有利于愈傷組織的增殖生長(zhǎng),但愈傷擴(kuò)增率低于添加高質(zhì)量濃度PIC 的處理;培養(yǎng)基中添加高質(zhì)量濃度NAA 的處理中,有胚性愈傷組織分化為根的現(xiàn)象,培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素不利于愈傷組織的生長(zhǎng)與分化。
2.3.1 外觀形態(tài)特征
初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)的‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)2 ~3 次后,外觀如圖2所示。愈傷組織出現(xiàn)6 種形態(tài)特征:1)松散透明狀愈傷組織,繼代培養(yǎng)后仍為松散狀(圖2A);2)致密白色霧凇狀愈傷組織,在解剖鏡下觀察其為顆粒狀(圖2B);3)綠色愈傷組織,在解剖鏡下觀察其為綠色顆粒狀(圖2C);4)致密片狀愈傷組織,解剖鏡下觀察其為透明狀細(xì)胞(圖2D);5)絮狀披針形愈傷組織,整體呈松軟狀態(tài),部分膨大增殖,無(wú)胚性(圖2E);6)透明褐色愈傷組織(圖2F)。在這6 類愈傷組織中,松散透明愈傷組織的分散性最好,隨著培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加不褐化,仍保持良好的胚性,可增殖;致密白色愈傷組織和致密綠色愈傷組織質(zhì)地較硬,增殖較快。這3 種愈傷組織為胚性愈傷組織。絮狀披針愈傷組織增殖快,質(zhì)地松軟;致密片狀愈傷組織及透明褐色愈傷組織狀態(tài)差,不增殖。這3 種愈傷組織為非胚性愈傷組織。
圖2 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的外觀形態(tài)Fig.2 The status of subcultured callus of P.ostii cv.‘Phoenix White’ on callus proliferation medium
在添加了6 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 或添加了6 mg/L PIC 和0.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基上,成熟胚外植體的愈傷誘導(dǎo)率高,誘導(dǎo)效果較好,且愈傷組織擴(kuò)增2 ~3 代后形成松散透明、致密白色和致密綠色愈傷組織的比例高,分別為88.89%、82.35%和63.63%。在培養(yǎng)基中添加其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后,愈傷組織經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生致密片狀、絮狀披針形及透明褐色愈傷組織的比例較高,分別為70.00%、62.50%和83.30%。
2.3.2 組織細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征
胚性和非胚性愈傷組織不但外觀形態(tài)差異明顯,而且其形態(tài)細(xì)胞學(xué)形態(tài)也存在明顯差異,‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的組織細(xì)胞學(xué)形態(tài)如圖3所示。松散透明狀愈傷組織的細(xì)胞排列較緊密,細(xì)胞染色深,細(xì)胞核小,且有明顯的分生中心(圖3A);致密白色愈傷組織的細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞染色較淺,細(xì)胞核?。▓D3B);致密綠色愈傷組織的細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞染色深,細(xì)胞核小,有明顯的分生中心。結(jié)果表明,松散透明、致密白色和致密綠色愈傷組織的細(xì)胞為胚性細(xì)胞,有進(jìn)一步分化出植株的可能。致密片狀愈傷組織的細(xì)胞染色淺,無(wú)明顯的胚性細(xì)胞及分生組織中心;絮狀披針形愈傷組織的細(xì)胞有明顯的細(xì)胞核,但細(xì)胞分散、排列不規(guī)則,無(wú)明顯的分生中心;透明褐色愈傷組織的細(xì)胞染色淺,部分細(xì)胞有細(xì)胞核,且細(xì)胞核大,大多數(shù)細(xì)胞排列不規(guī)則,無(wú)明顯的胚性細(xì)胞及分生組織中心。這3 類為非胚性愈傷組織,較難進(jìn)一步分化出植株。
圖3 ‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織的組織細(xì)胞學(xué)形態(tài)Fig.3 Histological observation of callus tissues on P.ostii cv.‘Phoenix White’
本試驗(yàn)中研究了不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度對(duì)‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織增殖的影響,結(jié)果表明不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上愈傷組織易褐化,添加少量NAA 易使胚性愈傷組織發(fā)育為根,極少分化出芽,添加高濃度的生長(zhǎng)素PIC 和少量細(xì)胞分裂素容易使愈傷組織增殖,這一研究結(jié)果與張建偉等[25]對(duì)粗枝云杉的研究結(jié)果一致。誘導(dǎo)14 d 后,成熟胚開(kāi)始形成愈傷組織,PIC 和TDZ 為適宜‘鳳丹白’成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)和擴(kuò)增的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,繼代培養(yǎng)后松散透明、致密白色和致密綠色的愈傷組織具有分化潛能。
植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)木本植物(如樟樹(shù)[26]、冬青[27]等)外植體形成愈傷組織的關(guān)鍵因素,應(yīng)用于愈傷組織誘導(dǎo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類越來(lái)越多。PIC 是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于2,4-D 的除草劑[28],目前已被廣泛應(yīng)用于球根類植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo),且已取得良好效果[29-31]。DIC 是一種安息香酸系的除草劑,近年來(lái)也開(kāi)始被應(yīng)用于植物愈傷組織的誘導(dǎo)[32-33]。本試驗(yàn)中研究了培養(yǎng)基添加PIC 或DIC 對(duì)成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響,結(jié)果表明培養(yǎng)基中添加這2 種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)牡丹成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)效果均優(yōu)于添加2,4-D,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率高,胚性好。殷麗青等[21]報(bào)道,在添加4.0 mg/L PIC 的培養(yǎng)基上,‘鳳丹’幼胚的愈傷誘導(dǎo)率達(dá)98.1%,效果優(yōu)于2,4-D,與本研究結(jié)果一致。本研究中培養(yǎng)基添加DIC 后的愈傷誘導(dǎo)率略低于添加PIC,但誘導(dǎo)效果的差異不顯著,說(shuō)明除了PIC 外,DIC 也適用于牡丹成熟胚外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。高濃度的生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑共同添加能顯著提高‘鳳丹白’的愈傷誘導(dǎo)率。TDZ 是一種人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,具有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的雙重功能,在植物體內(nèi)較為穩(wěn)定,比BA 活性高[34-35]。本研究中,在牡丹愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加TDZ 較添加6-BA 和KT 這2 種細(xì)胞分裂素有更好的效果,與Zheng 等[36]在大蒜愈傷組織誘導(dǎo)研究中得出的結(jié)果一致。
植物體細(xì)胞胚間接發(fā)生途徑一般是體細(xì)胞經(jīng)過(guò)重編程后形成胚性愈傷組織,再?gòu)挠鷤M織中的胚性細(xì)胞分化形成體細(xì)胞胚。一般情況下,誘導(dǎo)體細(xì)胞胚產(chǎn)生的胚性愈傷組織從中柱鞘細(xì)胞和非中柱鞘類細(xì)胞發(fā)育而來(lái),胚性愈傷組織形成后,其表面或內(nèi)部產(chǎn)生由分裂旺盛、排列相對(duì)緊密的小細(xì)胞組成的胚性細(xì)胞團(tuán)[37]。而非胚性愈傷組織的構(gòu)成細(xì)胞一般大小不一致,細(xì)胞質(zhì)稀,液泡較大,細(xì)胞分化能力差。
本研究中,牡丹愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)后出現(xiàn)不同的顏色和質(zhì)地,組織學(xué)鑒定結(jié)果表明有的為胚性愈傷組織,有的為非胚性愈傷組織。在培養(yǎng)基中同時(shí)添加PIC 和細(xì)胞分裂素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,更容易誘導(dǎo)出具有再生潛能的胚性愈傷組織。在添加了6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L TDZ 或添加了6.0 mg/L PIC 和0.5 mg/L 6-BA 的培養(yǎng)基上,成熟胚外植體的愈傷誘導(dǎo)率高,誘導(dǎo)效果較好,且愈傷組織擴(kuò)增2 ~3 代后形成松散透明、致密白色或致密綠色愈傷組織的比例高。在培養(yǎng)基中添加其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑后,愈傷組織經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)生致密片狀、絮狀披針形及透明褐色愈傷組織的比例較高。在仙客來(lái)[38]和朱頂紅[39]等植物的研究報(bào)道中也存在類似現(xiàn)象。
非胚性愈傷組織與胚性愈傷組織之間可以相互轉(zhuǎn)換,其取決于所添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度和愈傷組織本身的狀態(tài),只有具胚性的愈傷組織才可能分化出體細(xì)胞胚或再生植株。因此,對(duì)愈傷組織進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)鑒定有利于篩選可分化的組織材料。為實(shí)現(xiàn)不同類型胚性愈傷組織再生能力的早期鑒定,縮短不同品種牡丹再生體系建立的周期,下一步擬觀察統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織成苗率,并進(jìn)行不同類型愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組分析,嘗試開(kāi)發(fā)與愈傷組織胚性和再生潛能相關(guān)的分子標(biāo)記,并從分子水平闡明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基添加物促進(jìn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的機(jī)制。