戴啟強(qiáng) 杜學(xué)鋒 王愛東 章文龍

肝癌早期癥狀較隱匿、病情進(jìn)展快、治療難度大且預(yù)后較差，是一種常見的惡性腫瘤，我國肝癌發(fā)病率及死亡率均居世界首位，在消化系統(tǒng)腫瘤死亡率中居第3位[1]。肝癌具有早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特點(diǎn)，目前治療主要以順鉑（cisplatin）等常規(guī)化療藥物為主，但易產(chǎn)生化療耐藥，造成腫瘤復(fù)發(fā)，最終導(dǎo)致患者死亡[2-3]。腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境是影響惡性腫瘤預(yù)后的重要因素，也可能是腫瘤細(xì)胞化療耐藥的始動(dòng)因素[4]。低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）可上調(diào)與腫瘤化療耐藥有關(guān)的基因表達(dá)，其功能主要取決于α 亞基，主要分為HIF-1α 和HIF-2α 兩種亞型[5]。HIF-2α 是腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)局部缺氧等微環(huán)境發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及耐藥過程中發(fā)揮重要作用[6]。目前大多數(shù)研究都致力于HIF-2α 對(duì)乳腺癌、肝癌等癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲影響的研究，而關(guān)于HIF-2α 對(duì)人肝癌阿霉素耐藥細(xì)胞株（HepG2/ADM）耐藥的研究較少，且與自噬的關(guān)系也不清楚。因此，本研究探究HIF-2α 對(duì)自噬介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞HepG2/ADM cisplatin耐藥的影響及機(jī)制，以期為疾病的臨床治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：XY-183-02165）、FBS（批號(hào)：XY-M-M6546）均購自上海熹垣生物科技有限公司；青霉素/鏈霉素（批號(hào)：S17032）購自上海源葉生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)：KTC011001）購自武漢艾美捷科技有限公司；微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）抗體（批號(hào)：18725-1-AP）購自美國Proteintech 公司；cisplatin（批號(hào)：IC0440）購自上海恒斐生物科技有限公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（批號(hào)：T2191a）、轉(zhuǎn)染試劑盒（批號(hào)：SL100688）均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；Beclin 1 抗體（批號(hào)：SPC-600S）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（批號(hào)：SPC-5110） 均購自加拿大StressMarq 公司；缺氧誘導(dǎo)因子-2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）抗體（批號(hào)：BS90635）、β-actin 抗體（批號(hào)：BM6017）均購自武漢益普生物科技有限公司；PDVF 膜（批號(hào)：70335-90）購自北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒（批號(hào)：R40014）、BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：R21250）均購自上海源葉生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯/碘化丙啶（annexinv-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，AnnexinV-FITC/PI）細(xì)胞凋亡雙染試劑盒（批號(hào)：556547）購自上海復(fù)申生物科技有限公司。RT-60000 型酶標(biāo)儀購自上海信裕生物科技有限公司；GelDocEZ 型全自動(dòng)蛋白凝膠成像儀購自美國Bio-Red公司；DxFLEX 型流式細(xì)胞儀購自上海莫瑞生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞與培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2 和HepG2/ADM 均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，-80 ℃冰箱取出后37 ℃溶解，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，再添加含10%FBS、100 U/ml 青霉素-鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、飽和濕度、5%CO2。HepG2/ADM 細(xì)胞在培養(yǎng)過程中加1 μg/ml cisplatin 以維持其順鉑耐藥性。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將兩種肝癌細(xì)胞分為以下各組：（1）HIF-2α-siRNA＋cisplatin 組：HepG2/ADM 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-2α-siRNA 后加入終濃度5 μmol/L 的cisplatin；（2）HIF-2α-siRNA 組：HepG2/ADM 細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF-2αsiRNA；（3）NC-siRNA 組：HepG2/ADM 細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體；（4）3-MA＋cisplatin 組：HepG2/ADM 細(xì)胞貼壁后加入終濃度為5 mmol/L 的3-MA 和cisplatin；（5）cisplatin組：HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞貼壁后加入終濃度5 μmol/L 的cisplatin；（6）3-MA 組：HepG2/ADM 細(xì)胞貼壁后加入終濃度為5 mmol/L 的3-MA；（7）對(duì)照組：HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞不作任何處理，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。siRNA 轉(zhuǎn)染參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作，HIF-2α-siRNA 干擾序列：5'-TGAAAACGAGTCCGAAGCC-3' 和5'-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3'，引物由上海生工生物公司合成。

1.2.3 各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。將HIF-2α-siRNA 組、NC-siRNA 組、cisplatin 組、3-MA 組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液后用PBS 洗滌3次，加入0.1 ml 預(yù)冷的RIPA 裂解液，冰浴30 min，4 ℃、10 000 r/min 離心30 min，吸取上清液蛋白。采用BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白總濃度。加樣緩沖液與蛋白樣品等體積混合，沸水煮10 min。采用10% SDS-PAGE 電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移至PDVF 膜上，封閉液室溫封閉2 h，加LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α、β-actin 抗體（1∶1 000 稀釋）作為一抗，4℃孵育過夜，次日TBST 洗膜3 次后加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 500 稀釋）作為二抗，室溫孵育2 h，ECL 顯色，Kodak 膠片曝光。采用Gel-Proanalyzer 圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.2.4 各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將HIF-2α-siRNA＋cisplatin 組、HIF-2α-siRNA 組、NC-siRNA 組、3-MA＋cisplatin 組、cisplatin 組、3-MA 組、對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書操作：各組細(xì)胞經(jīng)PBS 溶液洗滌2 次后收集細(xì)胞，Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入100 μl 含AnnexinV-FITC和PI 的緩沖液中，混合后室溫避光下孵育20 min，最后于流式細(xì)胞儀中測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 各組細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 按1×104個(gè)/孔的密度將處于對(duì)數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染HIF-2α-siRNA HepG2/ADM 細(xì)胞接種于96 孔板，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，過夜培養(yǎng)，待貼壁后加入終濃度為1.25、2.5、5、7.5、10 μmol/L的cisplatin，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后按CCK-8 試劑盒說明書操作進(jìn)行計(jì)數(shù)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光值（A），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平比較

2.1.1 cisplatin 組和對(duì)照組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平比較 cisplatin 組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平較HepG2 細(xì)胞均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 cisplatin 組和對(duì)照組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)電泳圖（HepG2/ADM 為人肝癌阿霉素耐藥細(xì)胞株；LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ；HIF 為低氧誘導(dǎo)因子）

2.1.2 3-MA 組和對(duì)照組、HIF-2α-siRNA 組和NCsiRNA 組HepG2/ADM 細(xì)胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)水平比較 3-MA 組HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均顯著下降（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA 組HepG2/ADM 細(xì)胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)水平較NC-siRNA組均顯著下降（均P＜0.05）。見圖2、表2。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.2.1 cisplatin 組和對(duì)照組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率比較 cisplatin 組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均顯著升高（均P＜0.05）；cisplatin 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較HepG2 細(xì)胞顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.2.2 各組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率比較 3-MA＋cisplatin 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較cisplatin 組、3-MA 組和對(duì)照組均顯著升高（均P＜0.05），cisplatin 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較3-MA 組和對(duì)照組均顯著升高（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA＋cisplatin 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較HIF-2α-siRNA 組、NC-siRNA 組和cisplatin 組均顯著升高（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA 組和NC-siRNA 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率較cisplatin組均顯著降低（均P＜0.05），見表4。

表1 cisplatin 組和對(duì)照組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平比較

圖2 4 組HepG2/ADM 細(xì)胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)電泳圖（HepG2/ADM 為人肝癌阿霉素耐藥細(xì)胞株；HIF 為低氧誘導(dǎo)因子；LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白1 輕鏈3-Ⅱ）

表2 4 組HepG2/ADM 細(xì)胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)水平比較

表3 cisplatin 組和對(duì)照組HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率比較（%）

2.3 各濃度組細(xì)胞增殖抑制率比較 沉默HIF-2α 表達(dá)后，隨cisplatin 處理濃度增加，HepG2/ADM 細(xì)胞增殖抑制率升高，見表5。

3 討論

肝癌發(fā)病迅速、流行性廣、生存率低，致死率僅次于肺癌和胃癌，居惡性腫瘤第3 位，嚴(yán)重威脅人類健康。cisplatin 是肝癌治療中療效較好的一種化療藥物，為許多肝癌患者帶來了希望。然而目前為止，化療過程中產(chǎn)生的肝癌細(xì)胞耐藥性是影響化療失敗的主要因素[7-8]。因此，如何控制肝癌細(xì)胞cisplatin 耐藥的發(fā)生，提高藥物敏感性及治療效果，是近年來人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。局部缺氧是腫瘤發(fā)生耐藥性的重要機(jī)制之一，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧耐受最重要的因子是HIF，而cisplatin 能夠抑制腫瘤血管生成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤缺氧發(fā)生，此機(jī)制可能是肝癌細(xì)胞產(chǎn)生cisplatin 耐藥，進(jìn)而影響其療效的重要原因[9-10]。因此，HIF 可能與肝癌細(xì)胞耐藥有密切聯(lián)系。

表4 各組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率比較（%）

表5 各濃度組細(xì)胞增殖抑制率比較（%）

HIF-α 是HIF 蛋白的調(diào)節(jié)和活性亞基，在多種腫瘤生長及耐藥中發(fā)揮重要作用[11-12]。HIF-2α 是細(xì)胞氧信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[13]。自噬在癌癥化療中既能保護(hù)耐藥細(xì)胞又能促進(jìn)耐藥細(xì)胞死亡，與腫瘤分期、腫瘤類型、腫瘤微環(huán)境及治療方案等密切相關(guān)[14]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老和凋亡可減少化療藥物劑量、有效提高腫瘤治療效果、減少化療不良反應(yīng)，因此cisplatin 是促進(jìn)癌細(xì)胞衰老、凋亡的有效化療藥物[15]。楊書才等[16]通過Western blot 等方法研究HIF-2α 對(duì)肝癌化療耐藥性的影響及機(jī)制，證明HIF-2α 可通過上調(diào)LRP、MDR1 等耐藥基因的表達(dá)從而增加肝癌細(xì)胞的耐藥性。李春男等[17]通過檢測(cè)肝細(xì)胞生成素Cn（hepatopoietin Cn，HPPCn）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，最終證明HIF-2α 參與索拉非尼耐藥的發(fā)生，HPPCn 沉默通過抑制HIF-2α 來影響缺氧誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥。本研究結(jié)果顯示，cisplatin 處理HepG2、HepG2/ADM 細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率均顯著升高，且HepG2/ADM 細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表達(dá)水平較HepG2 細(xì)胞升高，提示HepG2/ADM 細(xì)胞的自噬水平及HIF-2α 蛋白表達(dá)水平均較高；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，cisplatin 可能導(dǎo)致HepG2、HepG2/ADM 肝癌細(xì)胞凋亡率及自噬水平升高的同時(shí)，亦會(huì)導(dǎo)致HIF-2α 蛋白表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3-MA 處理HepG2/ADM 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表達(dá)水平均下降，提示3-MA 處理導(dǎo)致HepG2/ADM 細(xì)胞的自噬水平受到抑制。而3-MA＋cisplatin 組HepG2/ADM 細(xì)胞凋亡率顯著高于cisplatin 組，提示抑制自噬可有效提高HepG2/ADM 細(xì)胞的cisplatin 敏感性，同時(shí)推測(cè)誘導(dǎo)自噬可能在HepG2/ADM 細(xì)胞中起到抵抗cisplatin 損傷的作用，進(jìn)而保護(hù)癌細(xì)胞；再進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，siRNA 可同時(shí)抑制HIF-2α 蛋白和細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)水平；沉默HIF-2α 表達(dá)后，隨cisplatin 處理濃度增加，HepG2/ADM 細(xì)胞增殖抑制率升高，提示抑制自噬可能對(duì)HepG2/ADM細(xì)胞的cisplatin 敏感性有一定影響，同時(shí)推測(cè)誘導(dǎo)自噬可能在HepG2/ADM 細(xì)胞中起到抵抗cisplatin 損傷的作用，進(jìn)而保護(hù)癌細(xì)胞。

綜上所述，本研究采用HIF-2α-siRNA 抑制HIF-2α 表達(dá)后，HepG2/ADM 細(xì)胞自噬水平受到抑制、凋亡率顯著提高、增殖抑制率顯著上升，表明HIF-2α 可有效地提高HepG2/ADM 細(xì)胞對(duì)cisplatin 的敏感性，下調(diào)HIF-2α 表達(dá)可能成為增強(qiáng)腫瘤化療藥物療效的新手段。然而其具體作用機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到多種蛋白，尚需進(jìn)一步深入研究。