華宏軍 陳萍 葉曉華 丁進

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，也是全世界死亡率最高的癌癥之一。在所有新發(fā)癌癥病例當中，HCC 病例占將近5.7%，全球范圍內每年約有1%患者的死因與HCC 相關[1-2]。HCC具有惡性程度高、病情進展快、患者生存期短等特點，因此其病死率居高不下[3]。臨床上由于HCC 細胞易發(fā)生侵襲與轉移從而導致HCC 在確診時往往已發(fā)展到晚期，這也是手術和介入治療HCC 失敗的根本原因。

相關研究表明，黏著蛋白激酶（focal adhesion kinase，FAK）在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、HCC、結直腸癌等多種腫瘤中均處于高表達和過度活化的狀態(tài)，在細胞之間及細胞與細胞外基質黏附侵襲中起著重要作用，同時與腫瘤細胞生存、增殖、凋亡、周期調控、遷移等有著密切關系[4-5]。PF573228 是目前研究較多的一種ATP 競爭的FAK 抑制劑，具有高效、高特異性的特點[6-7]。本課題組前期研究發(fā)現，FAK 抑制劑PF573228 能夠影響非小細胞肺癌細胞系A549 的增殖及克隆的形成[8]。盡管FAK作為腫瘤靶點在多種癌癥中機制相對明確，然而在HCC 中，新型競爭性抑制劑PF573228 抗腫瘤效果及其作用機制有待深入研究?；谇捌诘难芯炕A，本項目擬探討FAK 抑制劑PF573228 對HCC 的抑制效果以及作用機制，為其臨床應用提供實驗數據并奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞系與培養(yǎng)方式 人HCC 細胞系（HepG2 和SMMC-7721）均購自美國ATCC 細胞庫；DMEM 細胞培養(yǎng)基購自美國Thermofisher 公司，細胞培養(yǎng)條件為含10%FBS 的DMEM，5%CO2和37 ℃培養(yǎng)。在無菌條件下用0.25%胰酶消化，在顯微鏡下觀察到80%的細胞形態(tài)開始變圓時，取2 ml 細胞培養(yǎng)液加入細胞培養(yǎng)瓶中終止消化，重懸細胞備用。

1.1.2 抗體 FAK 抗體、磷酸化FAK（FAK 397）抗體均購自美國CST 公司，CD15s、鈣黏附蛋白E（E-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH、辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠抗體（SA00001-1）、HRP 標記羊抗兔抗體（SA00001-2）均購自美國PTG 公司。

1.1.3 試劑盒 PF573228 購自上海MCE 公司；FastKing RT Kit（With gDNase）購自北京天根生化科技有限公司；RAPI 裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；Matrigen 基質膠購自美國BD 生物公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒購自日本東仁化學科技有限公司；ECL 試劑盒購自杭州寶科生物有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組 HepG2 細胞和SMMC-7721 細胞均培養(yǎng)至對數生長期進行實驗，具體分組：將HepG2 細胞和SMMC-7721 細胞加入等量不同濃度PF573228 處理（終濃度分別為0、0.01、0.1、1、10 μM）；另對HepG2 細胞和SMMC-7721 細胞轉染pcDNA-CD15s 質粒進行過表達處理，分為pcDNA-CD15s 組、PF573228 組、PF573228+pcDNA-CD15s 組。

1.2.2 pcDNA-CD15s 質粒構建 引物擴增CD15s 全長Forward primer：限制性內切酶（BamHI）-CGGGATCCATGAGGCGCTTGTGGGGCGCG Reverse primer：限制性內切酶（XhoI）-CCCTCGAG-TCACCGCTCGAACCAGCT，通過BamHI 和XhoI 雙酶切pcDNA 和CD15s，回收得到待連接片段，以pcDNA 和CD15 比例為1∶5，16 ℃過夜酶連，轉化，氨芐青霉素篩選單克隆，送測序，確定pcDNA-CD15s 構建成功，用內毒素質粒提取試劑盒進行質粒提取。其中H-pcDNA-EGFP、S-pcDNA-EGFP 分別為HepG2 細胞和SMMC-7721 細胞的空白質粒載體，H-pcDNA-CD15s、S-pcDNA-CD15s 分別為HepG2 細胞和SMMC-7721 細胞的CD15s 質粒載體。

1.2.3 細胞相對活力檢測 采用CCK-8 法。HCC 細胞以1×104個/孔植入96 孔板中，培養(yǎng)48 h 后，加入CCK-8 溶液（20 μl/孔），37 ℃培養(yǎng)2 h，使用酶標儀測定450 nm 波長下各孔光密度（OD）值。細胞相對活力=（實驗組OD 值-空白組OD 值）/（對照組OD 值-空白組OD 值）。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 小室實驗。取處對數生長期的HCC 細胞接種于6 孔板中。用不含血清的DMEM 稀釋matrigel 基質膠，使用冷卻過的槍頭，在24 孔上小室中加入50 μl 稀釋過的基質膠，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置0.5 h 待用，計數1×105個/孔的HCC 細胞植入24 孔cornning 上小室中，在下小室中加入20%FBS，培養(yǎng)8 h 后用棉簽擦去上小室的基質膠，把上小室放入結晶紫溶液中染色30 min，用PBS 洗兩次，放入新24 孔板中，隨機選取5 個視野計數穿膜細胞數，每組設3 個復孔，取平均值。

1.2.5 總RNA 提取和cDNA 合成 收取轉染或者PF573228 處理后的細胞，用1 ml Trizol 試劑裂解5 min，離心后加入200 μl 氯仿，混勻15 min，4 ℃離心取上層水相，加入等體積異丙醇沉淀10 min，4 ℃離心，用75%乙醇溶液洗1 次，干燥加水溶解，Nanodrop2000 定量，取1 μg RNA，根據天根反轉錄試劑盒，合成cDNA，10 倍稀釋。

1.2.6 CD15s 相對表達量檢測 采用熒光定量PCR法。取1 μl 稀釋后的cDNA 樣本，使用SYBR GREEN 法對基因進行定量分析。轉染效率的驗證：以空白質粒載體pcDNA-EGFP 作為對照，對CD15s 質粒（pcDNA-CD15s）進行定量分析，判斷質粒是否成功轉染至靶細胞。引物：細胞周期依賴性激酶抑制因子Forward primer：TGTCCGTCAGAACCCATGC，Reverse primer：AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC；細胞周期蛋白E Forward primer：AAGGAGCGGGACACCATGA，Reverse primer：ACGGTCACGTTTGCCTTCC；細胞周期蛋白D1 Forward primer：GCTGCGAAGTGGAAACCATC，Reverse primer：CCTCCTTCTGCACACATTTGAA；細胞黏附分子CD15s Forward primer：GATCTGCGCGTGTTGGACTA，Reverse primer：GAGGGCGACTCGAAGTTCAT；FAK Forward primer:GCTTACCTTGACCCCAACTTG，Reverse primer：ACGTTCCATACCAGTACCCAG；GAPDH Forward primer:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Reverse primer：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.2.7 不同處理組E-Cadherin、Vimentin、FAK、FAK397及CD15s 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。收集106個細胞/樣本加入50 μl RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，離心后將上清液轉移至新EP 管中，測濃度，并加入10 μl 6×loading buffer 混勻，95 ℃加熱5 min，-80 ℃環(huán)境儲存。取20 μl 儲存的溶液加入10%的PAGE膠后上樣，待藍色loading buffer 跑至底部進行轉膜，轉膜條件為200 mA，3 h 轉膜完畢后，取膜用TBS 洗兩遍，在5%脫脂奶粉的TBST 中封閉1 h，根據目的條帶進行切膜，根據抗體說明書稀釋一抗，并在4 ℃搖床上孵育過夜，用TBST 洗兩遍，在室溫下孵育二抗，用TBST 洗3 次，20 min/次。使用寶科生物ECL 試劑盒，A、B 溶液1∶1 混合，用伯樂凝膠成像系統(tǒng)進行顯影、分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPASS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PF573228 處理組HCC 細胞相對活力比較 CCK-8 實驗發(fā)現，隨著PF573228 濃度增加，兩種HCC 細胞相對活力均逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 不同濃度PF573228 處理組肝癌細胞相對活力比較

2.2 不同處理組HCC 細胞侵襲數比較 Transwell 侵襲實驗中，發(fā)現HCC 細胞侵襲數隨PF573228 藥物濃度的升高而降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1、圖2（插頁）。另外，PF573228 組與pcDNA-CD15s 組相比，細胞侵襲數顯著降低，而PF573228+pcDNACD15s 組與PF573228 組相比，細胞侵襲數有所回升，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2、圖3（插頁）。

表1 不同濃度PF573228 處理組HepG2、SMMC-7721 細胞侵襲數比較（個/HP）

2.3 HepG2、SMMC-7721 細胞CD15s 相對表達量比較 與H-pcDNA-EGFP 組、S-pcDNA-EGFP 組比較，H-pcDNA-CD15s 組、S-pcDNA-CD15s 組中CD15s 相對表達量均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 3 組肝癌細胞侵襲數比較（個/HP）

表3 兩組肝癌細胞CD15s 的相對表達量比較

2.4 不同處理組E-Cadherin、Vimentin、FAK、FAK397及CD15s 蛋白表達水平比較 Western blot 實驗結果顯示，E-cadherin 蛋白表達水平隨PF573228 藥物濃度的升高而增加，而Vimentin 蛋白表達水平隨藥物濃度的升高而降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4、5。而FAK397 及CD15s 蛋白表達水平均隨PF573228藥物濃度的升高而不斷下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），不同濃度組FAK 蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見圖6、7。進一步對細胞轉染pcDNA-CD15s 質粒進行過表達處理，發(fā)現與PF573228組比較，PF573228+pcDNA-CD15s 組E-cadherin 蛋白表達水平有所降低，Vimentin 蛋白表達水平有所增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖8。

3 討論

目前，基于FAK 信號通路的小分子抑制劑已應用于臨床，如FAK 抑制劑11-epi-SA 在HCC 細胞HA22T上能夠抑制細胞外信號調節(jié)激酶（ERK1/2）、絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和FAK/磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（FAK/PI3K/AKT/mTOR）信號通路進而抑制細胞轉移，從而發(fā)揮抗HCC的作用[9]。另一種FAK 抑制劑PF562271 能夠在小鼠模型中抑制乳腺癌的生長和轉移，體外實驗中能夠抑制肺癌細胞的生長[10]。然而相比于上述FAK 抑制劑，以Y397為靶點的FAK 抑制劑PF573228 比富含脯氨酸的酪氨酸激酶2、周期蛋白依賴性激酶1/7 和糖原合成酶激酶-3β 的選擇性更高，效率高達50～250 倍，對腫瘤臨床治療具有更好的效果。

圖4 不同濃度PF573228 處理組E-Cadherin、Vimentin 蛋白的電泳圖（E-Cadherin 為鈣黏附蛋白E；Vimentin 為波形蛋白）

圖5 不同濃度PF573228 處理組E-Cadherin、Vimentin 蛋白表達水平比較（E-Cadherin 為鈣黏附蛋白E；Vimentin 為波形蛋白）

圖6 不同濃度PF573228 處理組FAK、FAK397 及CD15s 蛋白表達的電泳圖（FAK 為黏著蛋白激酶；FAK397 為磷酸化黏著蛋白激酶）

圖7 不同濃度PF573228 處理組FAK、FAK397 蛋白表達水平比較（FAK 為黏著蛋白激酶；FAK397 為磷酸化黏著蛋白激酶）

圖8 各組間E-Cadherin、Vimentin 蛋白表達的電泳圖（E-Cadherin為鈣黏附蛋白E；Vimentin 為波形蛋白）

腫瘤細胞的侵襲及轉移被認為與MAPK 信號通路相關。MAKP 屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，由多個亞家族組成，其中較為明確的是在細胞功能中發(fā)揮重要作用的ERK1/2、c-Jun N 端激酶（JNK）以及p38MAPK。MAPK信號系統(tǒng)，主要由MAPK、MAPK 激酶（MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKKK）等3 類保守的蛋白激酶組成，通過級聯反應不斷磷酸化下游靶蛋白最終激活MAPK[11-12]。磷酸化的MAPK 使細胞質與細胞核內轉錄因子活化、相應的目標基因轉錄及表達，從而參與和調控細胞的生長發(fā)育、存活、分裂、凋亡、自噬等生物過程，與此同時MAPK也能活化下游通路的蛋白激酶，參與相應的生物活動過程。相關研究表明[13]，p38MAPK 信號轉導通路的激活可以抑制腫瘤細胞的侵襲和抗腫瘤血管的生成，而JNK信號通路的活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦存在十分密切的關系。MAPK 信號通路可影響細胞外基質的降解是其主要機制之一，同時其還可影響腫瘤轉移過程的多個環(huán)節(jié)。MAKP 信號通路是FAK 影響細胞遷移和侵襲關鍵的下游信號通路。有研究發(fā)現，復發(fā)轉移乳腺癌中，埃茲蛋白、FAK 能夠協同作用激活ERK/MAPK 通路[14-15]；在結直腸癌組織中，酪氨酸專一性蛋白激酶（Src）、FAK、JNK呈高表達，和腫瘤的分化程度呈負相關，且Scr、JNK 的表達與FAK 呈正相關，這提示FAK/Src/JNK 信號通路在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[16-17]。此外，細胞黏附分子在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著雙重作用，一方面腫瘤細胞必須先通過黏附分子的下調，繼而從原發(fā)灶脫落；另一方面又需要通過細胞外基質受體或內皮細胞配體的上調，繼而與細胞外基質受體或內皮細胞黏附而移動，才能形成轉移灶。CD15s 是近些年來發(fā)現的與腫瘤惡性發(fā)展有直接相關的黏附分子。CD15s 抗原是單唾液酸神經節(jié)糖苷脂CA19-9 的同分異構體，是黏附分子選擇素（CD62）所識別的較確定的一個配基。CD15s 是一種新的腫瘤相關抗原，在結腸癌、肝細胞癌、乳腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤細胞表面表達明顯增強，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和患者預后有著密切相關[18-20]。E-cadherin 是鈣黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亞型的黏附因子的一員，其相對分子質量為120 KDa，由細胞外肽段、跨膜區(qū)和細胞內肽段構成，主要存在于人和動物的上皮細胞中。E-cadherin 的嗜同性特異黏附作用主要是細胞間的E-連接素的胞外段共同形成“拉鏈”結構的黏附鏈接。在細胞膜上β-連環(huán)蛋白與E-cadherin 組成復合體，β-連接素和γ-連接素保持細胞的特性，維護上皮細胞的結構完整性和形態(tài)具有重要作用。通過對HCC、胃癌、前列腺癌、大腸癌、鼻咽癌、結直腸癌及甲狀腺癌等腫瘤的研究證實，腫瘤的分化、侵襲和轉移與E-cadherin 表達降低有著十分密切的聯系[21-22]。因此深入研究HCC 細胞侵襲和轉移能力的機制并以此為基礎探索防治HCC 的有效措施具有十分重要的意義。

綜上所述，探討PF573228 對FAK 和CD15s 蛋白的相互作用對深入研究其抑制HCC 轉移的機制具有重要作用，這也將成為本課題組今后研究的重點方向。