楊永志 陳煒

大腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，同時也是癌癥相關死亡的主要原因。目前，盡管大腸癌的診斷和治療策略已取得了很大的進步，但由于其高發(fā)病率和高死亡率，大腸癌仍是嚴重危害公共健康的疾病[1-2]。因此，發(fā)現(xiàn)大腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵生物標志物，為大腸癌的診斷和治療開辟更有效的靶點成為目前研究的熱點。磷酸甘油酸突變酶1（phosphoglycerate mutase 1，PGAM1）是一種重要的糖酵解酶，可在糖酵解途徑中催化3-磷酸甘油酸酯轉化為2-磷酸甘油酸酯[3]。PGAM1通常在腦、肝和腎組織中表達，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1 在神經膠質瘤[4]、乳腺癌[5]、口腔鱗狀細胞癌[6]等多種惡性腫瘤中存在過表達，并與腫瘤細胞的遷移、增殖和凋亡有關。PGAM1 高表達可激活蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路誘導的Warburg 效應，促使腫瘤細的增殖，抑制其凋亡[7]。本研究采用免疫組化En Vision 法檢測PGAM1 和mTOR 蛋白在大腸癌和相應癌旁組織中的表達情況，分析其表達與大腸癌臨床病理特征的關系及兩種蛋白表達的相關性，初步從蛋白水平探討PGAM1 和mTOR 表達改變與大腸癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 選取2015 年1 月至2018 年12 月臨海市第一人民醫(yī)院手術切除的大腸癌標本60 例，所有標本術后均經病理檢查診斷為大腸癌，術前均未接受化療、放療及免疫治療等。60 例大腸癌患者中，男34 例，女26 例，年齡33～77（58.72±10.61）歲。組織學分級：高、中分化39 例，低分化21 例；參照2010 年美國癌癥聯(lián)合委員會/國際抗癌聯(lián)盟制訂的TNM 分期標準：Ⅰ期和Ⅱ期28 例，Ⅲ期和Ⅳ期32 例；淋巴結轉移情況：有轉移者18 例，無轉移者42 例；所有患者均有完整的臨床病理資料。同時取患者的癌旁組織（距腫瘤原發(fā)灶＞5 cm）作為對照，病理檢查診斷為正常大腸組織。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者及家屬均知情同意。

1.2 主要試劑 羊抗人PGAM1 多克隆抗體和兔抗人mTOR 多克隆抗體均購自英國Abcam 公司；EnVision 通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購自上?；蚩萍加邢薰?。

1.3 檢測方法 所有組織標本離體后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋保存。制作4 μm 厚的石蠟切片，常規(guī)切片后烤片、二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液脫水。采用En Vision 二步法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。0.1 mmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液高壓抗原修復，正常山羊血清封閉30 min，一抗4 ℃冰箱過夜，二抗孵育30 min，顯微鏡下觀察，中性樹膠封片。用已知陽性片做陽性對照，以PBS 液代替一抗做陰性對照。

1.4 結果判定 PGAM1 和mTOR 均以細胞質內出現(xiàn)淡黃色至棕褐色顆粒為陽性信號。在光學顯微鏡下，每張切片隨機選取5 個高倍視野（×400），觀察并記錄細胞染色強度：無顯色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。記錄陽性細胞數(shù)的百分比：陽性細胞數(shù)百分比≤25%為1 分；26%～50%為2 分；51%～75%為3 分；＞75%為4 分。兩項計分的乘積為每張切片的最終積分，最終積分＜3 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman 秩相關。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌和癌旁組織中PGAM1 和mTOR 陽性表達率比較 PGAM1 和mTOR 在大腸癌組織中的陽性表現(xiàn)見圖1、2（插頁）。大腸癌組織中PGAM1 和mTOR 的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 大腸癌和癌旁組織中PGAM1 和mTOR 陽性表達率比較[例（%）]

2.2 PGAM1 和mTOR 陽性表達與大腸癌臨床病理特征的關系 PGAM1、mTOR 陽性表達與浸潤深度、淋巴結是否轉移、TNM 分期均有關（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度均無關（均P ＞0.05），見表2。

表2 PGAM1 和mTOR 表達與大腸癌臨床病理特征的關系[例（%）]

2.3 大腸癌組織中PGAM1 和mTOR 表達的相關性 在60 例大腸癌組織中，PGAM1 和mTOR 表達均陽性30例，PGAM1 表達和mTOR 表達均陰性14 例，PGAM1 表達和mTOR 表達呈正相關（r=0.427，P＜0.05），見表3。

3 討論

酶作用機制的改變是腫瘤細胞代謝的重要生化特征，其將代謝模式從氧化磷酸化切換為放大的糖酵解，并在缺氧條件下促進乳酸的產生。據報道，在24 種不同類型的癌癥中存在幾種糖酵解酶和葡萄糖轉運蛋白的過度表達，這些癌癥約占全球所有癌癥病例的70%。因此，靶向糖酵解酶可以作為抗癌藥物設計的潛在途徑。PGAM1 是一種重要的糖酵解酶，可催化3-磷酸甘油酸轉化為2-磷酸甘油酸。 研究表明，PGAM1 在幾種人類癌癥中過度表達，并與腫瘤的生長、存活和侵襲有關[8-9]。Liu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1 在已發(fā)生臨床轉移的胰腺導管腺癌（PDAC）組織和高度轉移性胰腺癌細胞株中過表達。沉默PGAM1 可降低高度轉移性胰腺癌細胞的偽足延伸，并使細胞分散性降低；Transwell 實驗證實了PGAM1 對胰腺癌細胞系遷移和侵襲的促進作用；并且與弱轉移細胞系相比，這種促進作用在高度轉移細胞系中更為明顯，表明PGAM1 過表達促進PDAC 的侵襲和轉移，可作為PDAC 侵襲、轉移的潛在治療靶點。本研究結果顯示，大腸癌組織中PGAM1 陽性表達率明顯高于癌旁組織，提示PGAM1 過表達可能在大腸黏膜上皮惡變過程中起促進作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1 陽性表達與大腸癌浸潤深度、淋巴結是否轉移、TNM 分期均有關，表明PGAM1 陽性表達可能增強大腸癌的浸潤深度和淋巴結轉移能力，與上述文獻報道結果一致。

表3 PGAM1 和mTOR 在大腸癌組織中表達的相關性（例）

mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide3kinase, PI3K）相關的激酶家族[11]。mTOR 是細胞自噬的主要抑制因子，是PI3K/AKT 信號通路的下游靶點[12]。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在調控細胞增殖、凋亡、代謝、分化和細胞周期等多種細胞過程中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究結果顯示，與癌旁組織比較，大腸癌組織中mTOR 陽性表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，這提示mTOR 陽性表達率升高可能是大腸癌發(fā)生的促進因素。進一步分析大腸癌不同臨床病理特征與mTOR 陽性表達的關系，結果顯示隨著大腸癌浸潤深度加深、淋巴結發(fā)生轉移及TNM 分期增加，大腸癌組織mTOR 陽性表達率進一步提高，差異有統(tǒng)計學意義，這表明mTOR 陽性表達與大腸癌浸潤、轉移密切相關。

本研究中PGAM1 表達和mTOR 表達均陽性者30例，PGAM1 表達和mTOR 表達均陰性者14 例，提示大腸癌組織中PGAM1 和mTOR 表達呈正相關，表明兩者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中可能存在協(xié)同調控作用。Ren 等[14]采用RNA 干擾技術敲低肝癌細胞中PGAM1 的表達，抑制糖酵解水平和ATP 生成，進一步激活結節(jié)性硬化復合物，降低三磷酸鳥苷結合蛋白的活性，進而抑制下游mTOR 信號通路，引起細胞周期阻滯和細胞自噬等。提示PGAM1 和mTOR 可能通過協(xié)同調控作用參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

綜上所述，大腸癌組織中PGAM1 和mTOR 表達明顯升高，這種異常高表達可能與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，PGAM1 和mTOR 有望成為大腸癌預后判斷及靶向治療的分子標志物。