郁峰 沈鋒 黃路橋

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的大腸黏膜慢性炎癥和潰瘍性病變，其病因病機尚未闡明[1]。美沙拉嗪是治療UC 的首選藥物，但具有一定的不良反應，近年來受到越來越多的關(guān)注[2]。中醫(yī)認為大腸濕熱型UC 屬外感外邪，以濕為主，由于久病脾胃虛弱、水濕不化、蘊生濕熱、下注大腸所致。相關(guān)研究表明，參白湯對大腸濕熱型UC 有一定的療效[3-4]。IL-27 是腸黏膜屏障的保護因子之一，發(fā)生UC 時可在腸上皮細胞中檢測到IL-27 受體高表達，從而有利于維持腸道屏障功能，減少黏膜上的微生物對固有免疫細胞的刺激[5-6]。本研究探討參白湯聯(lián)合美沙拉秦治療大腸濕熱型UC 的臨床療效及其對IL-27 表達的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2016 年1 月至2017 年12 月在浙江省立同德醫(yī)院門診或住院確診為大腸濕熱型UC 患者60 例為研究對象，其中男34 例，女26 例；年齡25～65（39.01±9.58）歲；體重45～85（58.44±7.65）kg；病程2～13（7.33±2.02）個月。按隨機數(shù)字表法分為兩組：觀察組30例，給予美沙拉嗪聯(lián)合參白湯口服治療；對照組30 例，僅予美沙拉嗪口服治療。兩組患者性別、年齡、體重、病程等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05），見表1。納入標準：（1）UC 符合《UC 中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[7]相關(guān)診斷標準，中醫(yī)辨證為大腸濕熱型；（2）患者可接受口服中藥湯劑。排除標準：（1）合并其他腸道疾病，如腫瘤、結(jié)核、克羅恩病、細菌性痢疾等；（2）合并其他全身活動性疾病；（3）孕婦和哺乳期婦女；（4）心理和精神障礙者；（5）目前或計劃參加其他臨床研究者。試驗終止標準：（1）因出現(xiàn)嚴重合并癥、并發(fā)癥、病情變化等不宜采用參白湯治療；（2）依從性差，不能有效配合治療和檢測；（3）出現(xiàn)不良事件。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

表1 兩組患者基本資料比較

1.2 治療方法 （1）觀察組給予美沙拉嗪口服治療，1 g/次，3 次/d；同時給予參白湯口服治療，早、晚服用150 ml 左右，該湯劑由黃芪15 g、黨參15 g、炒白術(shù)10 g、赤芍15 g、川黃連5 g、吳茱萸3 g、白芍15 g、廣木香10 g、白頭翁15 g、馬齒莧15 g、蛇舌草15 g、焦山楂10 g、炒薏仁15 g、陳皮5 g、茯苓10 g、肉豆蔻10 g、炒槐花15 g、枳殼10 g、甘草3 g 組成，由浙江省立同德醫(yī)院中藥房煎制；治療4 周為1 個療程。（2）對照組僅給予美沙拉嗪口服治療，1 g/次，3 次/d，治療4 周為1 個療程。1.3 觀測指標 治療后對兩組患者進行臨床療效評價，同時評估Mayo 評分，并與治療前進行比較。治療前后兩組患者均行結(jié)腸鏡檢查，取新鮮的結(jié)腸黏膜組織浸沒在預保護緩沖液中，置于-70 ℃冰箱內(nèi)備用，以檢測IL-27 蛋白及mRNA 表達。

1.3.1 臨床療效評價 根據(jù)《對炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的建議》進行評價[8]：臨床癥狀消失，大便次數(shù)≤2 次/d，大便無紅、白細胞為顯效；臨床癥狀基本消失，大便次數(shù)2～4 次/d，大便成形，大便紅、白細胞均＜10 個/HP 為有效；臨床癥狀及結(jié)腸鏡檢查未見好轉(zhuǎn)為無效。總有效率=（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100.0%。

1.3.2 UC 活動度評價 采用Mayo 評分標準進行評價：總分≤2 分且單項評分≤1 分為臨床緩解；總分3～5分為輕度活動；總分6～10 分為中度活動；總分11～12分為重度活動。

1.3.3 IL-27 蛋白表達檢測 采用免疫組化SP 法。取結(jié)腸黏膜組織，甲醛固定、石蠟包埋、5 μm 厚切片、脫水，置于帶正電的載玻片上；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min，3%正常血清阻斷蛋白30 min；滴加兔抗人IL-27，4 ℃培養(yǎng)18 h。山羊抗鼠IgG 抗體堿性磷酸酶偶聯(lián)物在室溫下孵育60 min，檢測結(jié)合情況。蘇木精復染，透明、封片；采用盲法在光學顯微鏡下行免疫組化染色切片形態(tài)測定。隨機選取5 個視野，采用Image pro plus 5.1.1 進行圖像分析，評估染色強度和陽性細胞占比。染色強度評分：陰性染色為0 分，弱陽性染色為1 分，中度陽性染色為2 分，強陽性染色為3 分；陽性細胞占比評分：每個樣本所見陽性細胞無為0 分，1%～25%為1 分；＞25%～50%為2 分；＞50%～75%為3 分；＞75%～100%為4 分。每張切片染色強度評分與陽性細胞占比評分之積，即免疫組化評分。

1.3.4 IL-27 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用20 ng cDNA、200 nM 正反向引物和Taqman Master Mix（德國羅氏診斷公司）進行IL-27 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的PCR 擴增（IL-27 上游引物為5′-GCCAGGAGTGAACCTGTACC-3′，下游引物為5′-TGGTGGAGATGAAGCAGAGA-3′，GAPDH 上游引物為5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物為5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′，擴增片段長度為134 bp）。PCR 在光循環(huán)機中進行45 個周期，每個周期包括95 ℃變性15 s，引物55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40 ℃冷卻30 s。采用2-ΔΔCt法計算IL-27 mRNA 相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)治療前后比較采用配對樣本t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者療效比較 治療后，觀察組顯效、有效、無效分別為16、12、2 例，總有效率為93.33%（28/30）；對照組顯效、有效、無效分別為13、9、8 例，總有效率為73.33%（22/30）。觀察組患者療效明顯優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（Z=1.97，P＜0.05）。

2.2 兩組患者治療前后Mayo 評分比較 治療前兩組患者Mayo 評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；治療后兩組患者Mayo 評分均明顯降低，且觀察組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者治療前后Mayo 評分比較（分）

2.3 兩組患者治療前后結(jié)腸黏膜組織中IL-27 蛋白表達的免疫組化評分比較 IL-27 主要在結(jié)腸上皮細胞胞質(zhì)中表達。治療前兩組患者結(jié)腸黏膜組織中IL-27 蛋白表達的免疫組化評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；治療后兩組患者結(jié)腸黏膜組織中IL-27 蛋白表達的免疫組化評分均明顯降低，且觀察組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3 和圖1（插頁）。

表3 兩組患者治療前后結(jié)腸黏膜組織中IL-27 蛋白表達的免疫組化評分比較（分）

2.4 兩組患者治療前后結(jié)腸黏膜組織中IL-27 mRNA表達比較 治療前兩組患者結(jié)腸黏膜組織中IL-27 mRNA 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；治療后兩組患者結(jié)腸黏膜組織中IL-27mRNA 表達均明顯降低，且觀察組明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 兩組患者治療前后結(jié)腸黏膜組織中IL-27 mRNA 表達比較

3 討論

IL-27 是IL-6/IL-12 細胞因子家族的新成員，是一種由病毒誘導基因3（EBI3）和p28 組成的異二聚體細胞因子，通過異二聚體IL-27R（WSX-1）/gp130 受體復合物發(fā)出信號。IL-27 p28 是構(gòu)成IL-27 的特異性亞單位[9]。EBI3 或IL-27 p28 單獨存在時，沒有生物學活性；只有當它們不共價結(jié)合時，才能形成功能性IL-27。IL-27 促進Th1 細胞增殖，但抑制Th2、Th17 細胞和調(diào)節(jié)性T 細胞分化，其特殊的差異性調(diào)控使得IL-27 在不同疾病環(huán)境中具有促炎或抑炎的雙向調(diào)節(jié)功能。IL-27 在炎癥和自身免疫中的雙重作用機制尚不清楚。一般來說，IL-27 的促炎和（或）抗炎活性受到潛在免疫效應途徑、疾病分期、抗調(diào)節(jié)細胞因子和（或）T 細胞亞群的存在與否以及所研究的組織和（或）細胞類型的影響。雖然IL-27 在各種自身免疫性疾病進展中有著不同的結(jié)果，但其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用均能體現(xiàn)[10]。因此，IL-27 可能是治療自身免疫性疾病的一種新的潛在靶點。

腸上皮細胞表面有著完整的IL-27 受體，可以激活多種下游信號通路[11]。Th1、Th2 細胞亞群失平衡是導致腸黏膜免疫反應異常的關(guān)鍵因素。UC 患者腸黏膜屏障功能異常，腸腔內(nèi)抗原轉(zhuǎn)移至固有層，進一步激活固有層免疫細胞，導致腸黏膜異常炎癥反應。在發(fā)生腸道炎癥時，可檢測到IL-27 受體呈高表達[12]。除了對T 細胞的作用，IL-27 還能激活腸上皮細胞STAT3 及STAT6通路，促進上皮細胞增殖和黏膜屏障的重建。IL-27 還可以誘導腸上皮細胞清道夫受體DMBT1 及吲哚胺2，3-雙加氧酶1 基因的表達，促進抗菌蛋白的分泌，抑制腸道微生物的生長[13]。IL-27 的上述功能均有利于維持腸屏障功能，減少黏膜微生物對固有免疫細胞的刺激。研究表明，活動期UC 患者IL-27 水平明顯升高，但其與病情嚴重程度的相關(guān)性尚未清楚[5，14]。本研究結(jié)果證實，IL-27 在UC 患者結(jié)腸黏膜組織中呈高表達。

美沙拉嗪是治療UC 的首選藥物，通過抑制前列腺素的合成和炎癥因子的表達來減輕腸道炎癥。然而，該藥具有加重發(fā)燒、腹瀉和便血等癥狀的不良反應。一些患者表現(xiàn)為不耐受，臨床上很難與炎癥性腸病的潛在惡化進行區(qū)分[15]。據(jù)報道，使用美沙拉嗪后，約4.6%的UC患者出現(xiàn)腹瀉，1.4%的患者出現(xiàn)便血和發(fā)燒[16]。因此，研究氨基水楊酸類藥物不良反應的作用機制并尋找相應的替代藥物已迫在眉睫。參白湯主要由黃芪、黨參、炒白術(shù)、白芍等組成，具有補脾、滲濕止瀉、益氣調(diào)中的作用，對大腸濕熱型UC 患者的腹痛、腹瀉、便血等癥狀具有改善作用。研究表明，UC 患者經(jīng)參白湯治療后，Th17 細胞對于腸道炎癥和腸黏膜損傷相關(guān)因子IL-23、IL-17的分泌明顯減少[17-18]。腸黏膜屏障的完整性對于UC 的控制至關(guān)重要。完整的腸黏膜能有效防止細菌和內(nèi)毒素的侵襲，從而進一步減少炎癥介質(zhì)的釋放[19]。本研究采用參白湯聯(lián)合美沙拉嗪治療UC 患者，并與僅口服美沙拉嗪患者進行比較，其臨床療效更優(yōu)，Mayo 評分更低，IL-27 蛋白及mRNA 表達均明顯降低。因此，筆者推測參白湯可能通過降低IL-27 的分泌來維持腸黏膜屏障的完整性，從而減輕UC 患者的癥狀。

綜上所述，參白湯聯(lián)合美沙拉嗪治療大腸濕熱型UC 的臨床療效優(yōu)于單用美沙拉嗪；但目前關(guān)于參白湯的具體作用機制尚未明確，可能通過IL-27 途徑發(fā)揮治療作用。