宋 瑤,姜永紅,姜之炎,趙曉陽(yáng),肖 臻

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

肺炎支原體是介于細(xì)菌和病毒之間的最小病原微生物，能夠在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基上獨(dú)立存活，是能夠引發(fā)呼吸道感染的常見(jiàn)病原體。肺炎支原體可通過(guò)飛沫傳播，進(jìn)入人體后可有2～3周的潛伏期，繼而呈現(xiàn)相關(guān)的臨床癥狀，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)展為肺炎支原體肺炎，也會(huì)有大約1/3的人成為無(wú)癥狀的肺炎支原體攜帶者。肺炎支原體肺炎患者臨床表現(xiàn)主要以發(fā)熱、咳嗽為主，也有畏寒、頭痛、遍體不適等癥，病程在1～3周。支原體肺炎好發(fā)于3歲以上兒童及青年人，有地區(qū)流行的特點(diǎn)。目前關(guān)于肺炎支原體肺炎致病的具體機(jī)制仍不十分明確，主要包括呼吸道上皮黏附[1-2]、肺炎支原體直接侵犯細(xì)胞及免疫功能紊亂[3]等，氧化應(yīng)激引起的肺損傷與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[4]。近年來(lái)，隨著大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性報(bào)道逐漸增多[5],尋找新型治療藥物迫在眉睫。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥清肺通絡(luò)方能夠通過(guò)調(diào)控 NLRP3炎癥小體，改善免疫炎癥反應(yīng)，并抑制細(xì)胞凋亡[6]。本研究以氧化應(yīng)激反應(yīng)為切入點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建肺炎支原體肺炎小鼠模型，探討在氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的途徑中，中藥清肺通絡(luò)方治療肺炎支原體肺炎的作用，從中藥中找尋治療肺炎支原體肺炎的新思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 BALB/c小鼠100只，3周齡，體重(18±2)g。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016，合格證編號(hào)：20130016010285，檢疫后備用。SPF級(jí)動(dòng)物房，雄性分籠飼養(yǎng)，空白組與感染組隔離飼養(yǎng)，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和水，適應(yīng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品 阿奇霉素干混懸劑(輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20050062)；清肺通絡(luò)方采用中藥免煎顆粒劑(四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司)，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，方藥組成：桑白皮9 g、地骨皮9 g、桃仁9 g、矮地茶9 g、杏仁9 g、紫蘇子9 g、葶藶子9 g、甘草3 g。小鼠用藥劑量換算采用Bios氏公式，將100 mg阿奇霉素溶于10 mL蒸餾水，小鼠用量為0.25 mL/20 g；清肺通絡(luò)方每包中藥需水體積27.6 mL，小鼠用量0.25 mg/20 g。

1.3主要試劑 肺炎支原體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株 FH(美國(guó) ATCC 公司提供，產(chǎn)品號(hào)： ATCC15531)；一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；肺炎支原體核酸檢測(cè)試劑盒(Cat.#DA-D064，達(dá)安基因)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 將100只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、清肺通絡(luò)方組、阿奇霉素組、中西醫(yī)結(jié)合組，每組20只。正常組給予 0.9%氯化鈉50 μL/次早晚滴鼻，其余組給予支原體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株(將存儲(chǔ)在-80 ℃冰箱中混于等體積20%甘油凍存的肺炎支原體離心，分離甘油，加入無(wú)菌水后反復(fù)吹打，作為工作菌液備用)50 μL/次(含1×107ccu/mL)早晚緩慢滴入鼻腔使其進(jìn)入氣管支氣管，其中前1～3 d滴鼻造模，后8～10 d再次滴鼻造模。造模第1天開(kāi)始，正常組和模型組給予生理鹽水0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10d；清肺通絡(luò)方組給予清肺通絡(luò)方0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10d；阿奇霉素組給予阿奇霉素藥液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天；中西醫(yī)結(jié)合組給予阿奇霉素藥液0.25 mL/20 g灌胃，第1～3天和第8～10天，同時(shí)給予清肺通絡(luò)方0.25 mL/20 g連續(xù)灌胃10 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)第6天、第11天每組每次各處死小鼠10只，摘眼球取血，8 000 r/min離心，取上清備測(cè)；灌洗左肺，回收灌洗液；取右側(cè)肺組織3 mm×3 mm×3 mm，余置于10%福爾馬林中保存。

1.5.1肺組織切片病理觀察 小鼠肺組織樣本包埋與固定后，常規(guī)HE染色，封固保存，用顯微鏡拍照并采集分析樣本相關(guān)部位。

1.5.2肺組織中肺炎支原體DNA含量PCR法檢測(cè) 陰性質(zhì)控制品制備，取樣本勻漿至完全裂解離心，加入提取液混勻，取2 μL樣品裂解后的上清液離心；將肺炎支原體陽(yáng)性定量的參考品離心；具體PCR擴(kuò)增步驟按照ABI 7300擴(kuò)增儀的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用ABI Prism 7300 SDS Software。

1.5.3氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 生化法檢測(cè)小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA、SOD表達(dá)水平，檢測(cè)步驟和計(jì)算方法按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織病理表現(xiàn) 正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯病變，見(jiàn)圖1；模型組小鼠支氣管黏膜細(xì)胞壞死脫落管腔變窄，肺泡壁和間隔有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管擴(kuò)張充盈，肺泡壁變厚破壞，見(jiàn)圖2；清肺通絡(luò)方組小鼠支氣管管腔變窄較為明顯，肺泡壁和間隔有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管擴(kuò)張充盈較為明顯，部分肺泡壁變厚明顯，見(jiàn)圖3；阿奇霉素組小鼠支氣管腔變窄較不明顯，肺泡壁和間隔有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管中度擴(kuò)張充盈，部分肺泡壁變厚，見(jiàn)圖4；中西醫(yī)結(jié)合組小鼠支氣管管腔變窄不明顯，肺泡壁和間隔有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，微血管輕度擴(kuò)張充盈，肺泡壁變厚不明顯，見(jiàn)圖5。

2.2各組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量 實(shí)驗(yàn)第6天和第11天，正常組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量均為0，模型組均顯著增高(P均<0.05)，清肺通絡(luò)方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組均明顯低于同期模型組(P均<0.05)，且中西醫(yī)結(jié)合組明顯低于同期清肺通絡(luò)方組和阿奇霉素組(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)第11天與實(shí)驗(yàn)第6天比較，中西醫(yī)結(jié)合組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量明顯降低(P<0.05)，其他組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織中肺炎支原體DNA含量比較

2.3各組小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)第6天和第11天，與正常組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達(dá)水平均明顯增高(P均<0.05)，SOD表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)。與模型組比較，清肺通絡(luò)方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組NOS、iNOS、NO、MDA表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)，SOD表達(dá)水平均明顯增高(P均<0.05)。 實(shí)驗(yàn)第6天，阿奇霉素組肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD表達(dá)水平，肺組織中iNOS、NO、MDA表達(dá)水平，血清中NOS、MDA表達(dá)水平改善情況均明顯優(yōu)于清肺通絡(luò)方組(P均<0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液中NOS、iNOS、NO表達(dá)水平，肺組織中iNOS表達(dá)水平，血清中NO、MDA表達(dá)水平均明顯低于清肺通絡(luò)方組和阿奇霉素組(P均<0.05)，肺泡灌洗液中MDA表達(dá)水平，肺組織中NO、MDA表達(dá)水平，血清中NOS、iNOS表達(dá)水平均明顯低于清肺通絡(luò)方組(P均<0.05)，而各樣本中SOD表達(dá)水平均明顯高于清肺通絡(luò)方組和阿奇霉素組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)第11天，阿奇霉素組與清肺通絡(luò)方組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液、肺組織中SOD表達(dá)水平均明顯高于清肺通絡(luò)方組(P均<0.05)。見(jiàn)圖6～8。

3 討 論

肺炎支原體能夠附著在細(xì)胞膜上，將微管插入細(xì)胞同時(shí)釋放過(guò)氧化氫和超氧游離基，中性粒細(xì)胞和其他細(xì)胞可以在炎癥反應(yīng)過(guò)程中激活NOS、iNOS，并產(chǎn)生過(guò)量的NO，所以氧化應(yīng)激引起的肺損傷與肺炎支原體肺炎的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系[7]。研究表明，肺炎支原體肺炎患者外周血單核細(xì)胞存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體遭受外來(lái)致病因素侵襲時(shí)，中性粒細(xì)胞作為機(jī)體最主要的活性氧(ROS)來(lái)源，其活化產(chǎn)生大量ROS，而SOD廣泛參與到急性炎癥反應(yīng)中，含量大幅度降低，當(dāng)ROS產(chǎn)生多于體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的抗氧化儲(chǔ)備時(shí)，氧自由基對(duì)肺組織的影響大大增加[8-9]。氧化應(yīng)激是機(jī)體受到各種刺激后體內(nèi)的氧化與抗氧化作用失去平衡，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物堆積，致機(jī)體損傷的一種病理過(guò)程，其中由線粒體產(chǎn)生的ROS在氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用[10-11]。氧化應(yīng)激反應(yīng)釋放過(guò)量產(chǎn)生的ROS與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA結(jié)合發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，最終引起組織結(jié)構(gòu)與功能的破壞[12-13]。生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。另外氧自由基不但通過(guò)生物膜中多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過(guò)脂氫過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷[14]。故ROS、MDA、SOD是評(píng)價(jià)氧化-抗氧化系統(tǒng)的重要指標(biāo)，其中MDA為評(píng)估機(jī)體氧化損傷程度的重要依據(jù)，SOD可評(píng)價(jià)機(jī)體的抗氧化能力[15]。

肺炎支原體肺炎目前主要采用大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物治療，方法較為單一且因其耐藥性的產(chǎn)生，在很大程度上較為局限。中藥及復(fù)方有望發(fā)揮多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次的作用，對(duì)治療肺炎支原體肺炎具有潛在優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)學(xué)將肺炎支原體肺炎歸屬于“肺炎喘嗽”“咳嗽”“咳逆”“風(fēng)溫”等證的范疇。錢乙《小兒要證直絕·變蒸》有云：“五臟六腑，成而未全……全而未壯?！鼻宕鷧蔷贤ㄌ岢?“小兒稚陽(yáng)未充，稚陰未長(zhǎng)者也?！睆年庩?yáng)學(xué)說(shuō)出發(fā)，陰是指體內(nèi)精、血、津液、臟腑、血脈、腦髓、筋骨、肌膚等有形之質(zhì)，陽(yáng)是指體內(nèi)臟腑的生理功能的活動(dòng)，吳鞠通認(rèn)為小兒時(shí)期臟腑嬌嫩，行氣未充，衛(wèi)外不固，易感外邪。對(duì)于肺炎，在葉天士提出“溫邪上受，首先犯肺”，將其稱為風(fēng)溫之后，才歸入到溫病范疇之中?！杜R證指南醫(yī)案·溫?zé)帷酚性疲骸拔霚匦埃峭ǚ谓j(luò)。”鼻為肺之竅，指出溫邪可通過(guò)鼻竅直侵于肺絡(luò)，再通過(guò)肺絡(luò)進(jìn)行傳變[16]。肺炎支原體肺炎在于外邪入肺，郁而化熱，從而使氣機(jī)升降受阻，肺絡(luò)壅滯，清肅之能受損，邪熱熏蒸，從而出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰、氣促等[16]。本病的基本病機(jī)為多種因素導(dǎo)致的“肺絡(luò)”狹窄，即肺絡(luò)閉阻、肺失宣肅，具體表現(xiàn)為初因毒邪入肺，瘀而化熱，肺氣阻滯，氣不能運(yùn)血，血行滯澀，而脈絡(luò)失養(yǎng)；痰瘀壅阻肺絡(luò)，導(dǎo)致絡(luò)虛不榮，虛實(shí)夾雜，病情遷延難愈或易反復(fù)發(fā)作[17]。從病機(jī)出發(fā)，清肺通絡(luò)成為本病的治療關(guān)鍵。中醫(yī)治療的根本目的在于調(diào)整陰陽(yáng)，使肺絡(luò)恢復(fù)通暢。治療上，葉天士提出“絡(luò)以通為用”和“凡病宜通”的思想，通絡(luò)之法強(qiáng)調(diào)“絡(luò)以辛為泄”，包括辛溫通絡(luò)、辛苦通絡(luò)、辛香通絡(luò)、辛咸通絡(luò)、辛潤(rùn)通絡(luò)及蟲(chóng)類通絡(luò)[18]。對(duì)小兒支原體肺炎治法包括祛風(fēng)、解表、散寒、宣肺、活血、化瘀、清肺、化痰通絡(luò)等，應(yīng)根據(jù)不同致病因素選用不同治法，但歸其目的都是為了疏通絡(luò)脈，熱者清之，痰者滌而暢之，痰瘀互阻化而通之，脈絡(luò)不足、氣陰兩虛補(bǔ)而和之[19-20]。

清肺通絡(luò)方是在兒科經(jīng)典名方“瀉白散”合“蘇葶丸”的基礎(chǔ)上，以“肺絡(luò)”理論為指導(dǎo)，結(jié)合臨床實(shí)踐組方而成，該方秉承以清肺為基礎(chǔ)同時(shí)化痰祛瘀通絡(luò)的理念，從恢復(fù)肺絡(luò)氣血供給及運(yùn)行來(lái)改善支原體外邪所致的肺絡(luò)痹阻，維持正常肺的通氣與宣降功能。方中桑白皮為君藥、地骨皮為臣藥，兩者清熱瀉肺而宣通肺氣，肺之“氣絡(luò)”得通，使肺氣宣降得利，又治肺之虛熱，質(zhì)潤(rùn)不燥，瀉肺而不傷肺，對(duì)小兒體質(zhì)尤為適用；杏仁宣肺平喘，蘇子降氣化痰，葶藶子瀉肺平喘，三藥合用可在瀉白散的基礎(chǔ)上清肅肺氣、化痰通絡(luò)；桃仁活血潤(rùn)腸、止咳平喘，矮地茶止咳化痰、利濕活血，兩藥配伍可活血化瘀通絡(luò)，與瀉白散相配伍可增降氣平喘之效；甘草祛痰止咳，調(diào)和諸藥。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)第6天，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達(dá)水平明顯高于正常組，SOD表達(dá)水平明顯低于正常組，提示肺炎支原體肺炎小鼠體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)第11天，模型組小鼠肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達(dá)水平繼續(xù)上升，SOD表達(dá)水平繼續(xù)下降，說(shuō)明肺炎支原體感染后無(wú)藥物干預(yù)情況下，小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷持續(xù)加重。實(shí)驗(yàn)第6天和實(shí)驗(yàn)第11天，清肺通絡(luò)方組、阿奇霉素組和中西醫(yī)結(jié)合組肺泡灌洗液、肺組織、血清中NOS、iNOS、NO、MDA表達(dá)水平均明顯低于模型組，SOD表達(dá)水平明顯高于模型組，提示清肺通絡(luò)方和阿奇霉素可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)氧化反應(yīng)減輕肺炎支原體對(duì)機(jī)體造成的炎性損害。實(shí)驗(yàn)第6天，阿奇霉素組肺泡灌洗液中NOS、NO、SOD，肺組織中NO、iNOS、MDA，血清中NOS、MDA表達(dá)水平降低或升高程度均優(yōu)于清肺通絡(luò)方組；實(shí)驗(yàn)第11天，阿奇霉素組與清肺通絡(luò)方組各指標(biāo)比較均無(wú)明顯差異。說(shuō)明阿奇霉素序貫治療第6～10天中對(duì)體內(nèi)氧化/抗氧化指標(biāo)的調(diào)控效果有所下降，為今后臨床減少抗生素的使用提供了新的思考方向。本研究還發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激指標(biāo)在肺泡灌洗液、血清中的表達(dá)較為顯著，在臨床上可根據(jù)實(shí)際需求選擇檢測(cè)標(biāo)本類型。

綜上所述，清肺通絡(luò)方能夠抑制肺炎支原體肺炎小鼠體內(nèi)NOS與iNOS的活力，有效減少NO、MDA生成，提高SOD活力，起到調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)的作用，從而減輕肺部炎癥損傷，且清肺通絡(luò)方與阿奇霉素聯(lián)用作用更為顯著。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。