鮑 新，劉 琴，古 銳，鐘世紅，2

（1.成都醫(yī)學院藥學院，成都 610500；2.西南民族大學藥學院，成都 610200；3.成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 610075）

獨一味來源于唇形科獨一味屬植物獨一味［Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo］，是歷史悠久的藏族常用藥材，具有活血止血、祛風止痛的功效，廣泛用于治跌打損傷、外傷出血、風濕痹痛等癥［1，2］。近年來，獨一味止痛效果良好且無成癮性的優(yōu)勢，引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注，以獨一味為主要原料的成方制劑及下游產(chǎn)品的開發(fā)日益增多。逐年增長的藥用需求，導致其連年過度采挖，加之生態(tài)環(huán)境不斷退化，獨一味藥材資源日益減少，于2000 年被列為一級瀕危藏藥品種［3，4］。由于獨一味尚未實現(xiàn)規(guī)?；N植，商品全部來源于野生資源，因此研究獨一味種群特征，進而開展規(guī)?；N植已迫在眉睫。

種群中各年齡期個體數(shù)在種群中所占的比例是種群的年齡結(jié)構(gòu)［5］，植物種群年齡結(jié)構(gòu)的確定，是分析種群結(jié)構(gòu)特征、分布格局、演替規(guī)律的重要前提，可以解釋個體、種群與生境的相互關(guān)系。植株齡級的判斷是研究種群年齡結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)［6，7］，且其生長年限的確定也與藥材的品質(zhì)息息相關(guān)［8］。與木本植物可通過其年輪的環(huán)數(shù)確定年齡不同［9-11］，草本植物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上未見如此普及的鑒別特征，僅局限于禾本科、莎草科等植物依據(jù)分蘗類型判斷植株年齡［12，13］。多年生草本植物齡級劃分的困難，導致草本植物種群特征研究相對不足。近年來，一些多年生草本植物已陸續(xù)報道具有生長輪構(gòu)造［14，15］。包括藥用植物中的類似生長輪構(gòu)造，如人參［16］、芍藥［17］和川續(xù)斷［18］可在主根觀察生長輪，黃芩［19］根木質(zhì)部導管的排列方式可作為其生長年限辨別依據(jù)。然而，并非所有的多年生草本植物都具有生長輪構(gòu)造，有的植物生長輪構(gòu)造僅在部分產(chǎn)地植株中出現(xiàn)［20］，多年生草本植物的年齡確定相對較為困難。

本研究采集1～3 年生栽培獨一味植株，觀察并比較了不同生長年限獨一味的外觀性狀和顯微構(gòu)造，初步獲得了不同生長年限獨一味的形態(tài)組織學鑒別特征。為驗證結(jié)果，亦采集野外不同大小等級的獨一味進行觀測，來源于同一樣地的小、中、大等級野生獨一味植株表現(xiàn)出類似1～3 年生栽培獨一味的形態(tài)組織學特征差異。研究結(jié)果可為獨一味種群年齡結(jié)構(gòu)研究、種群動態(tài)預測提供參考，進而為合理利用、保護野生獨一味資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2016 年9 月至2018 年9 月，在四川省阿壩州若爾蓋縣熱爾大草地收集野生獨一味種子，播撒于四川省阿壩州茂縣三龍鄉(xiāng)進行栽培種植，于2020 年5 月采集1～3 年生獨一味植株各15 株。2020 年9 月在四川省甘孜州稻城縣采集未知年限的小、中、大3組獨一味樣品各15 株，經(jīng)西南民族大學藥學院鐘世紅教授鑒定為唇形科植物獨一味。

1.2 儀器與試劑

10000XL 根系分析掃描儀（日本EPSON 公司，WinRHIZO 分析系統(tǒng)）；BX41 和BX63 正置熒光生物顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；SMZ168 體式顯微鏡（中國Motic 公司）；TK-218 型自動輪轉(zhuǎn)切片機（德國Leica 公司）；B7126-A 型包埋機（德國Leica 公司）；番紅O-固綠植物組織染色液（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 測量性狀特征 獨一味新鮮植株用去離子水洗凈后濾紙吸干水分，電子分析天平分別稱量獨一味地上部分和地下部分鮮重；用坐標紙測定葉片長度和寬度；采用根系掃描儀掃描獨一味根系，保存圖片后運用WinRHIZO 2009 根系系統(tǒng)分析軟件分析總根長、總根表面積、總根體積、主根長、主根表面積、主根體積、主根直徑及根尖數(shù)等指標。

1.3.2 石蠟切片的制備 取新鮮1～3 年生栽培獨一味與未知生長年限小、中、大等級野生獨一味各15株，放入FAA 固定液中固定后，梯度乙醇脫水、梯度二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片（厚度為8 μm），番紅O-固綠染色，封片，分別制成葉橫切片與根橫切片，置于生物顯微鏡下觀察與拍照。

1.3.3 徒手切片的制備 撕取獨一味下表皮，稀甘油裝片，取任意清晰可見的視野置于顯微鏡下觀察與拍照，每張裝片觀察3 個視野，觀察氣孔、腺鱗的形態(tài)與數(shù)目，計算腺鱗密度［單位面積內(nèi)腺鱗的個數(shù)（個/mm2）］和氣孔指數(shù)［氣孔指數(shù)=100×氣孔個數(shù)/（氣孔個數(shù)+表皮細胞個數(shù)）］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析，使用ANOVA 和Duncan’s 法對試驗數(shù)據(jù)進行差異性分析。所有指標的數(shù)據(jù)均以15 個生物重復的平均值±標準誤差（±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長年限栽培與野生獨一味外觀性狀

獨一味為多年生草本；貼地生長；葉對生，4～6枚，多為菱狀圓形，基部下延至葉柄，邊緣具圓齒，葉表面皺縮，具短柔毛。一年生獨一味主根細長，無分枝，須根較少；二年生獨一味主根分枝0～2 個，須根較多；三年生獨一味主根粗大，偶見剝落的栓皮，較粗的根偶見枯心，根中部及下部出現(xiàn)分枝2～5 個，須根茂密（圖1）。

圖1 栽培獨一味

由表1 可以看出，栽培獨一味鮮重、根重、株高、葉長、葉寬、葉面積、根表面積、根體積、主根表面積、主根體積及主根直徑等隨著年限的增加均呈上升趨勢且有顯著差異（P＜0.05）。說明1～3 年均為獨一味的快速生長期。不同生長年限栽培獨一味的生物量積累趨勢存在差異，一年生根冠比為0.50，二年生根冠比為0.52，三年生為0.40，結(jié)合地上、地下生物量隨著生長年限呈上升趨勢，說明獨一味幼苗最初的2 年地上、地下部分增長接近，從第3 年開始，地上部分增長更為迅速。

表1 不同生長年限栽培獨一味生物量比較（±s，n=15）

表1 不同生長年限栽培獨一味生物量比較（±s，n=15）

注：“*”為差異顯著（P<0.05），“**”為差異極顯著（P<0.01）；表2同

指標 一年生 三年生二年生全株鮮重//g地上部分鮮重//g地下部分鮮重//g根冠比葉片總面積//cm2葉片總長//cm葉片總寬//cm代表葉片面積//cm2代表葉片長//cm代表葉片寬//cm總根長//cm總根表面積//cm2總根體積//cm3主根長//cm主根表面積//cm2主根體積//cm3主根直徑//cm根尖數(shù)//個0.36±0.24 0.25±0.17 0.12±0.07 0.50±0.20 6.77±5.29 7.95±1.94 4.95±1.83 2.45±1.78 2.45±0.67 1.50±0.49 121.40±87.99 11.34±7.13 0.09±0.05 13.25±2.08 3.47±0.79 0.08±0.04 0.85±0.28 561.13±265.79 8.99±5.10**6.57±3.98**2.40±1.18**0.40±0.08 94.93±56.15**27.76±8.38**25.13±9.03**35.54±15.02**7.23±1.10**6.42±1.85**248.53±19.57*52.12±22.65**1.01±0.45**15.98±3.42*14.09±4.06**0.99±0.43**2.80±0.45**706.00±409.74 2.59±0.71*1.73±0.53 0.86±0.23**0.52±0.13 33.63±7.95*17.17±4.27**12.73±3.30**11.97±2.49**4.93±0.52**3.60±0.47**253.98±143.60*36.67±13.97**0.46±0.14**14.42±4.38 7.92±2.42**0.36±0.14**1.76±0.31**687.00±383.94

未知年限的野生獨一味外觀性狀與人工栽培獨一味性狀呈相似規(guī)律，無論是地上部分還是地下部分生物量均出現(xiàn)增大趨勢。隨著植株的增大，根愈發(fā)粗壯且栓皮脫落，分枝逐漸增多，根部枯朽加重（圖2）。

圖2 野生獨一味

2.2 不同生長年限栽培與野生獨一味顯微特征

2.2.1 葉片下表皮 栽培獨一味的下表皮細胞垂周壁平直或微彎曲，氣孔多為不定式或不等式，可見腺鱗，腺頭多為4 細胞（圖3）。由表2 可以看出，隨著年限的增加，腺鱗密度減少且有極顯著差異（P<0.01），氣孔指數(shù)無明顯變化。

野生獨一味的下表皮氣孔、腺鱗和表皮細胞形態(tài)相似，不同大小等級的植株特征無明顯變化（圖4）。

2.2.2 葉橫切面 栽培獨一味葉上、下表皮細胞各1 列，外被角質(zhì)層，偶見非腺毛和腺鱗。柵欄組織排列緊密，多為2～3 列；海綿組織排列疏松，不過中脈。中脈維管束為外韌型，“U”形排列。1～3 年生獨一味下表皮內(nèi)側(cè)均為2～3 列厚角組織；一年生獨一味上表皮內(nèi)側(cè)未發(fā)現(xiàn)厚角組織；二年生獨一味上表皮內(nèi)側(cè)偶見厚角組織1～2 列；三年生獨一味上表皮內(nèi)側(cè)厚角組織2～3 列。一年生獨一味葉中脈維管束1個，木質(zhì)部導管十幾個聚集呈團狀排列；二年生獨一味葉中脈維管束1～2 個，木質(zhì)部導管數(shù)十個聚集呈環(huán)狀排列；三年生獨一味葉中脈維管束1～3 個，木質(zhì)部導管數(shù)十個聚集呈環(huán)狀排列（圖5）。

圖3 栽培獨一味葉下表皮（×400）

圖4 野生獨一味葉下表皮（×400）

結(jié)合表2 可知，隨著年限的增加，中脈逐漸膨大，葉片厚度逐漸增加且有極顯著差異（P<0.01），上、下表皮變化不顯著。

野生獨一味葉橫切面內(nèi)部結(jié)構(gòu)與栽培獨一味相似。小株獨一味中脈維管束1～2 個，上、下表皮內(nèi)側(cè)厚角組織2～3 列；中級大小獨一味中脈維管束1～3個，上、下表皮厚角組織3～5 列；大株野生獨一味中脈維管束1～4 個，上、下表皮內(nèi)側(cè)厚角組織4～5 列（圖6）。

圖5 栽培獨一味葉橫切面

圖6 野生獨一味葉橫切面

表2 不同生長年限栽培獨一味葉片指標比較（x±s，n=15）

2.3 根橫切面

栽培獨一味根木栓層由1～2 列細胞組成，呈深棕色；韌皮部細胞排列較緊密，形成層明顯，呈環(huán)狀，木質(zhì)部寬廣，不同生長年限栽培獨一味根導管排列方式不同。1～2 年生根導管單個散在或數(shù)個成束，呈扁平層狀排列，一年生根導管排列緊密，二年生根導管排列較稀疏；三年生根導管數(shù)十個成束切向連續(xù)排列成與環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖7）。

圖7 栽培獨一味根橫切面

野生獨一味根部顯微結(jié)構(gòu)與栽培獨一味相似，隨著植株的增大，枯朽逐漸加重。小株獨一味根中部細胞排列緊密，導管數(shù)十個成束切向連續(xù)排列成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；中級大小獨一味根中央部位具多輪木栓細胞環(huán)，其內(nèi)側(cè)薄壁細胞消失，有較大裂隙，各木栓細胞環(huán)層之間導管亦呈斷續(xù)環(huán)狀分布；大株獨一味根中部亦出現(xiàn)木栓細胞環(huán)，其內(nèi)側(cè)枯朽嚴重，呈較大空洞（圖8）。

圖8 野生獨一味根橫切面

3 小結(jié)與討論

本研究對1～3 年生栽培獨一味從外觀性狀和組織構(gòu)造進行了比較研究，不同生長年限的獨一味表現(xiàn)出一定的差異。為了進一步驗證，亦采集野生獨一味進行觀察，雖不能確定野生植株具體生長年限，但基于前期多年持續(xù)的野外觀察數(shù)據(jù)，葉片大小與齡級大小呈正相關(guān)趨勢，因此觀察來源于同一野生樣地小、中、大3 種大小級別的植株，獲得野生獨一味植株不同生長年限的特征趨勢。觀察結(jié)果表明，同一野生樣地小、中、大3 種大小級別的獨一味植株，具有類似栽培1～3 年生樣品的特征規(guī)律。

性狀特征比較顯示，隨著生長年限的增加，栽培獨一味出現(xiàn)分枝，二年生獨一味分枝0～2 個，三年生獨一味分枝2～5 個，且主根粗大，部分較粗的主根出現(xiàn)裂隙、枯心現(xiàn)象，偶見剝落的栓皮，須根較繁茂。而1～2 年生獨一味根未見枯心和剝落的栓皮，可據(jù)外部性狀初步判斷三年生獨一味。不同大小等級野生獨一味外觀性狀出現(xiàn)類似栽培1～3 年生栽培樣品的特征規(guī)律，隨著植株的增大，主根出現(xiàn)裂痕，且栓皮剝落程度、中部枯朽現(xiàn)象逐漸加重。

顯微組織觀察顯示，三年生栽培獨一味葉中脈維管束較發(fā)達，可達3 個，呈“U”形排列，而一年生葉的中脈維管束僅1 個；二年生葉的中脈維管束1～2個；三年生獨一味葉中脈上下表皮以下均可見厚角組織2～3 列，一年生葉中脈上表皮以下未見厚角組織，二年生葉的中脈上表皮以下偶見厚角組織1～2列。三年生獨一味根木質(zhì)部導管數(shù)較多，數(shù)十個成束切向連續(xù)排列成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而一年生根和二年生根導管單個散在或數(shù)個成束，未形成較連續(xù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。顯微組織方面可以從葉“U”形排列的中脈維管束，中脈上下表皮以內(nèi)的厚角組織，根環(huán)狀排列的木質(zhì)部導管判斷三年生獨一味。

野生獨一味葉中脈維管束和厚角組織的發(fā)達程度與植株的大小呈正比，與上述栽培獨一味規(guī)律相似。不同大小等級野生獨一味根內(nèi)部結(jié)構(gòu)生長規(guī)律類似栽培1～3 年生樣品的特征規(guī)律，小株獨一味根中心細胞排列緊密，木質(zhì)部導管數(shù)十個成束切向連續(xù)排列成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；中等大小獨一味根中心開始出現(xiàn)栓化，中部木栓層含有導管與木質(zhì)部導管呈平行環(huán)狀；大株獨一味根中心出現(xiàn)較大空洞，中部木栓層與外部木栓層呈同心環(huán)狀。

獨一味為多年生高原草本植物，但目前僅能采集可確定栽培年限的1～3 年生獨一味植株進行試驗。課題組亦采集了不同產(chǎn)地的野生獨一味植株進行形態(tài)組織學觀察，尤其仔細觀察了粗壯的大型植株，表現(xiàn)出主根粗壯、枝根數(shù)量多、須根繁茂、主根橫切面多有不同程度枯心的性狀特征；在根的顯微構(gòu)造上導管聚集明顯，切向排列成多輪斷續(xù)的扁平帶狀。隨著生長年限的增長，獨一味是否體現(xiàn)出類似生長輪的構(gòu)造，課題組將持續(xù)開展研究。

試驗試圖從次生代謝產(chǎn)物積累角度，尋找不同生長年限的獨一味植株差異。獨一味地上部分主要含有環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、酚酸類及黃酮類成分，地下部分主要含有環(huán)烯醚萜類和苯乙醇苷類成分。測定結(jié)果表明，無論是1～3 年生栽培獨一味樣品，還是不同大小等級野生獨一味樣品，其次生代謝產(chǎn)物含量均無顯著差異，即從次生代謝產(chǎn)物積累的角度暫未發(fā)現(xiàn)規(guī)律。