田 源，朱國星，司冠儒，梅 婕，張衛(wèi)衛(wèi)，張溫清，易 俊，高傳強(qiáng)

（1.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000；安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000）

芝麻香型白酒是建國后通過學(xué)創(chuàng)結(jié)合所創(chuàng)立的白酒香型，具有“芝麻香突出，諸味協(xié)調(diào)，豐滿細(xì)膩，回味悠長”的風(fēng)格特點(diǎn)，由于其獨(dú)特的風(fēng)味，使其成為白酒行業(yè)中發(fā)展最為迅速的白酒香型之一[1]。芝麻香型采用了泥底磚窖、清蒸續(xù)米查、大麩結(jié)合、高氮配料、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒、長期貯存的工藝技術(shù)特點(diǎn)，使其酒體風(fēng)味特征具有優(yōu)雅、細(xì)膩、飄逸、回味悠長的類似焙炒芝麻的香氣[2-3]。高粱作為主要原料，配以一定比例的小麥和麩皮，增加和豐富了芝麻香型白酒生產(chǎn)釀造原料的蛋白質(zhì)含量、種類以及氨基酸的構(gòu)成，為芝麻香型白酒風(fēng)格的形成提供了基礎(chǔ)[3-4]。

芝麻香型白酒的生產(chǎn)是利用純種群體微生物組合發(fā)酵的過程，優(yōu)質(zhì)的功能微生物菌種是純種發(fā)酵的關(guān)鍵之一[1]。因此，微生物菌種及其發(fā)酵功能的鑒定是群體微生物得以有效應(yīng)用的關(guān)鍵條件之一。酒醅蛋白水解率是影響芝麻香型白酒酒樣風(fēng)味質(zhì)量的重要指標(biāo)，蛋白水解率的高低也會(huì)使芝麻香型白酒的最終發(fā)酵結(jié)果產(chǎn)生差異[3]。因此，選擇合適的菌種，優(yōu)化現(xiàn)有工藝生產(chǎn)高產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌麩曲對(duì)于提高芝麻香型白酒的品質(zhì)有著重要意義。

本研究對(duì)宣酒細(xì)菌麩曲的種子培養(yǎng)基進(jìn)行碳源、氮源優(yōu)化，提高種子培養(yǎng)液中蛋白酶活力和菌株生物量。并通過優(yōu)化組合確定了產(chǎn)蛋白酶的最佳組合，提升芝麻香白酒高氮配料中氮源的利用率，為促進(jìn)制曲工藝的提升及進(jìn)一步提高芝麻香型白酒品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

菌株：宣酒小窖研究所保藏。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水至1000 mL，pH 值調(diào)至7.2，以115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨30 g，Na2HPO44 g，K2HPO40.3 g，加水至1000 mL，pH 值調(diào)至7.2，以115 ℃滅菌20 min。。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮650 g，豆粕300 g，稻殼50 g，氫氧化鈉4 g，加600 mL水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活測定方法

依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 28715—2012[5]，采用福林法測定。中性蛋白酶活力用蛋白酶活力單位表示，定義為1 g 液體或固體酶在40 ℃和pH 7.5 條件下，1 min 水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸，即為1 個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.2 四甲基吡嗪的測定方法

樣品中四甲基吡嗪的測定采用HPLC-MS法[6]。

1.2.3 高產(chǎn)蛋白酶麩曲固態(tài)組合發(fā)酵

7 株細(xì)菌曲功能菌株接種至裝有50 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液作為種子液按照組合方案的接種量接入裝有70 g 麩皮培養(yǎng)基的500 mL 搖瓶中，37 ℃靜置培養(yǎng)2 d。

稱取10 g 固體樣品，95 ℃烘干至恒重，計(jì)算其含水量。稱取固態(tài)培養(yǎng)物約5 g，測定蛋白酶酶活。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶優(yōu)化

考察不同碳源（可溶性淀粉、蔗糖、甘油、葡萄糖）和氮源（豆粕粉、酵母膏、蛋白胨）種類對(duì)產(chǎn)酶的影響，考察甘油質(zhì)量濃度（20 g/L、30 g/L、40 g/L）、豆粕粉質(zhì)量濃度（20 g/L、25 g/L、30 g/L）對(duì)產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基中的40 g/L葡萄糖分別用40 g/L可溶性淀粉、蔗糖、甘油替換。其他成分為蛋白胨30 g/L，Na2HPO44 g/L，K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h，測定6 株菌發(fā)酵液上清液中性蛋白酶酶活。結(jié)果如圖1 所示，碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響較大，對(duì)B2 而言葡萄糖的產(chǎn)酶效果最好，為433.15 U/g，其次為蔗糖、甘油、淀粉，但以甘油為碳源時(shí)B2 的生物量最高。而B1、B3、B4、B5、B6 在甘油作為碳源時(shí)，酶活最高，同時(shí)具備較高的生物量。結(jié)合成本、酶活和生物量三方面因素的考量，選擇甘油作為最佳碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.2 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選取甘油為最佳碳源，將發(fā)酵培養(yǎng)基中30 g/L蛋白胨分別用豆粕、酵母膏替換。其他成分為甘油40 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。以37 ℃、160 r/min 培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵上清液中性蛋白酶酶活。結(jié)果如圖2 所示，對(duì)B2 而言，豆粕的效果好于另外兩種氮源，酶活最高為548.8 U/g，其次是酵母膏、蛋白胨。當(dāng)前已有研究表明，無機(jī)氮源會(huì)抑制蛋白酶的形成[7]，因此沒有考察無機(jī)氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

綜合以上研究，選擇豆粕為最佳氮源。

2.3 甘油和豆粕濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

由上述研究結(jié)果可知，B2 產(chǎn)蛋白酶能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于另外5 株菌，因此選擇B2 考察甘油和豆粕濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響。以甘油作為最佳碳源，豆粕為最佳氮源，考察不同甘油濃度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響，設(shè)置甘油濃度20 g/L、30 g/L、40 g/L，豆粕20 g/L、25 g/L、30 g/L，其余成分為Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。對(duì)碳源和氮源濃度進(jìn)行組合，組合如表1所示。

表1 不同濃度甘油、豆粕組合發(fā)酵

由表1 可知，單獨(dú)調(diào)整碳源含量時(shí)，20 g/L 的甘油對(duì)蛋白酶的合成具有促進(jìn)作用，酶活最高為561.7 U/g，比30 g/L 和40 g/L 分別提高了9.2 %、10.4 %。適當(dāng)?shù)奶荚礉舛扔欣诰甑纳L和代謝，濃度過高可能由于菌株脫水導(dǎo)致生長遲緩，菌株代謝受阻，影響酶的合成。單獨(dú)對(duì)氮源含量進(jìn)行調(diào)整時(shí)，豆粕質(zhì)量為20 g/L 時(shí)酶活最高，最高為513 U/g，過高的豆粕含量同樣不利于蛋白酶的合成，這可能是由于固形物含量過多，會(huì)影響培養(yǎng)基的溶氧，進(jìn)而影響菌株的生長[8]。

對(duì)甘油和豆粕含量進(jìn)行組合調(diào)整時(shí)，結(jié)果表明，甘油20 g/L、豆粕25 g/L 最利于產(chǎn)酶，此時(shí)酶活達(dá)到800.2 U/g。綜合評(píng)估產(chǎn)蛋白酶的最適條件為甘油20 g/L、豆粕25 g/L。

2.4 接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，考察了5%、8%、10%、15%4 個(gè)接種量對(duì)B2 產(chǎn)酶的影響，以37 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h，測定其上清液中性蛋白酶活力。如表2所示，在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，蛋白酶酶活逐漸升高，10%的接種量酶活最高，為820.3 U/g。因此在實(shí)際生產(chǎn)上，在合理的范圍內(nèi)適當(dāng)增加接種量有助于提高蛋白酶酶活。

表2 接種量和轉(zhuǎn)速條件優(yōu)化

同時(shí)，考察了160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min 4 個(gè)轉(zhuǎn)速條件對(duì)B2 產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，隨著轉(zhuǎn)速提升，蛋白酶酶活逐步增加。說明提高轉(zhuǎn)速，增加培養(yǎng)基的溶氧，有利于蛋白酶的產(chǎn)生，在后續(xù)的上發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)，可以利用此特性來提高蛋白酶酶活。

2.5 功能性細(xì)菌三角瓶固態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)蛋白酶配方組合研究

由上可知，6 株芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力差異較大，但菌株在生產(chǎn)中除了提供蛋白酶以外，對(duì)多種香氣成分的合成影響較大。因此考慮對(duì)6 株菌進(jìn)行組合培養(yǎng)，在提高蛋白酶的同時(shí)充分發(fā)揮各個(gè)菌株的特性。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌麩曲菌株進(jìn)行純種培養(yǎng)，并進(jìn)行固態(tài)麩皮的組合發(fā)酵。上述研究可知B2 具有較強(qiáng)的蛋白酶活力，通過提高B2 的含量提高麩曲的蛋白酶活力。并且已有研究表明104 具有較高的蛋白酶酶活，同時(shí)四甲基吡嗪（TTMP）的合成能力較強(qiáng)[9]，在固態(tài)麩皮培養(yǎng)基中添加104，可以進(jìn)一步增加曲中蛋白酶酶活，同時(shí)具有提升四甲基吡嗪等指標(biāo)的潛力。選擇B1、B2、B3、B4、B5、B6 和104 進(jìn)行組合設(shè)計(jì)，進(jìn)行配方優(yōu)化，提升細(xì)菌麩曲品質(zhì)。

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基純種培養(yǎng)7 株菌種子液，按照配方優(yōu)化組合（表2）方案，按比例接種到麩皮固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，探尋產(chǎn)蛋白酶及四甲基吡嗪的最佳組合，分別對(duì)混合發(fā)酵結(jié)束的功能性細(xì)菌麩曲的四甲基吡嗪、蛋白酶、水分等指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表3，固態(tài)組合發(fā)酵結(jié)果見表4。

表3 配方設(shè)計(jì)

表4 固態(tài)組合發(fā)酵結(jié)果

10 個(gè)組合中有4 個(gè)組合蛋白酶活力達(dá)到一級(jí)曲的標(biāo)準(zhǔn)（蛋白酶酶活＞150 U/g）,有7 個(gè)組合達(dá)到二級(jí)曲的標(biāo)準(zhǔn)（蛋白酶酶活＞100 U/g）。其中A9組合的蛋白酶酶活最高，為337.6 U/g。B2 或者104比例的調(diào)整對(duì)蛋白酶酶活有著較大的影響，但是蛋白酶酶活并不是隨著B2 或者104 的比例的增加呈現(xiàn)線性的增長，而是在某些特定的比例下表現(xiàn)出較高的酶活，說明B2 或者104 比例的增加會(huì)提高細(xì)菌麩曲的蛋白酶酶活，但是其也受到其余菌株的影響，只有適宜的菌株和合適宜比例的混合發(fā)酵才會(huì)充分發(fā)揮出菌株的優(yōu)勢。就TTMP 而言，細(xì)菌麩曲中TTMP 含量隨著B2 比例的增加而增加，說明B2的存在有助于細(xì)菌麩曲中TTMP 的形成。組合A4的TTMP 含量最高，為2.8245 mg/L，但其蛋白酶酶活僅有109.8 U/g。而組合A9 具有較高蛋白酶酶活，同時(shí)TTMP 含量適中，今后可以在A9 組合的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵體系，在保障蛋白酶的同時(shí)提高TTMP的含量，提升麩曲品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)細(xì)菌麩曲發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化，確定了最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為甘油20 g/L、豆粕25 g/L、Na2HPO44 g/L、K2HPO40.3 g/L。最佳接種量為10 %，最適轉(zhuǎn)速為220 r/min。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)選取的7 株菌株進(jìn)行固態(tài)混合發(fā)酵配方組合研究以及不同比例情況下的對(duì)比驗(yàn)證，確定7株菌按照組合A9（B2∶104∶B1∶B3∶B4∶B5∶B6=3∶2∶1∶1∶1∶1∶1）混合發(fā)酵時(shí)，蛋白酶活力最高，同時(shí)能夠產(chǎn)生一定量的四甲基吡嗪。

通過本研究確定了細(xì)菌麩曲純種發(fā)酵培養(yǎng)基成分和固態(tài)組合發(fā)酵代謝產(chǎn)蛋白酶的最佳配比，為提高芝麻香型白酒生產(chǎn)中高氮配料中氮源的利用率，促進(jìn)芝麻香型白酒釀造用細(xì)菌曲制曲工藝的提升及改進(jìn)奠定了基礎(chǔ)，對(duì)芝麻香型白酒生產(chǎn)具有重要意義。