張立強(qiáng)，冉茂芳，王松濤，劉光錢，馬 卓，任劍波，沈才洪，許 濤

(1.瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川瀘州 646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000)

血栓疾病是一種由大量纖維蛋白和血小板凝集造成的嚴(yán)重性血管疾病，主要分為動(dòng)脈性、靜脈性和毛細(xì)血管性血栓，常常會(huì)引起人體中風(fēng)、腦梗死、心源性猝死等疾病。隨著生活節(jié)奏的加快及工作壓力的增加，人們的飲食和作息規(guī)律發(fā)生改變，血栓發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類的身體健康[1-2]。治療血栓疾病主要有外科手術(shù)、抗血小板凝集、抗凝血藥及纖溶酶（鏈激酶、尿激酶、組織型纖溶酶原激活劑）等4 種療法，但是，這些療法費(fèi)用高昂、用量大、半衰期短、專一性差、副作用較多且醫(yī)療效果有限[3]。1987 年，日本科學(xué)家Sumi 等[4-5]首次從日本納豆中發(fā)現(xiàn)了納豆激酶，一種具有很高纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，不僅可以直接分解纖溶蛋白，而且可以刺激細(xì)胞釋放組織纖溶酶原激活劑。與其他纖溶酶如尿激酶、鏈激酶及其他溶栓藥物相比，納豆激酶具有安全性高、成本低、纖溶活性強(qiáng)、可口服和作用時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)[6]。納豆激酶的發(fā)現(xiàn)將纖溶酶的篩選來源引向了微生態(tài)環(huán)境，經(jīng)過30 多年的研究，產(chǎn)纖溶酶的微生物尤以耐熱的芽孢桿菌為最多，如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[1]。芽孢桿菌合成的纖溶酶為絲氨酸及金屬肽酶，可以水解纖維蛋白、纖維蛋白原和合成的物質(zhì)，在pH5～12 及10～75 ℃條件下仍保持一定的活性[7]。

大曲為白酒釀造過程中的酶制劑、微生物及香味物質(zhì)來源，分低溫大曲、中溫大曲和高溫大曲。瀘州老窖大曲為中高溫大曲，其發(fā)酵頂溫可達(dá)50～60 ℃，經(jīng)過發(fā)酵，其中富集了大量的耐熱芽孢桿菌，可合成大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶類。此外，其代謝合成的生理活性物質(zhì)如吡嗪類化合物、地衣素、氨基酸活性短肽等可能會(huì)通過蒸餾進(jìn)入到白酒中，使白酒具有一定的養(yǎng)生保健功能[8-9]。因此，中高溫大曲中可能存在潛在的合成耐受性較高的纖溶酶的微生物。本研究擬以瀘州老窖中高溫大曲為樣品，從中篩選纖溶活性較高的芽孢桿菌，為溶栓藥物的開發(fā)、功能性保健酒及保健食品的開發(fā)提供功能性微生物資源，有利于充分挖掘釀酒微生物資源和揭示白酒預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等的養(yǎng)生保健功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：中高溫大曲，瀘州老窖股份有限公司。

試劑及耗材：氫氧化鈉、葡萄糖、麥芽糖、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、酵母提取物、蝦殼粉、氯化鈉、草酸銨結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、番紅、乙醇、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣分析純，本地化學(xué)試劑商店；瓊脂糖Sigma-Aldrich；脫脂牛奶、牛血纖維蛋白原、尿激酶、牛凝血酶，上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl、DNA 提取液、蛋白酶K、蝸牛酶、溶菌酶、Tris-HCl、EDTA、CTAB，上海生工生物工程有限公司；VITEK-2 革蘭氏陽性芽孢桿菌鑒定卡，法國梅里埃公司。

儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)SW-CJ-2G，上海諾萱科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)CR22N，日本日立；高壓滅菌鍋344，日本三洋；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；水浴鍋HH-6，金城碩華儀器廠；VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國梅里埃公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基和溶液

初篩培養(yǎng)基[10]：脫脂奶粉6.0%、牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5 %、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5 %～2.0 %，pH7.0，115 ℃滅菌15 min。

復(fù)篩培養(yǎng)基：瓊脂糖-纖維蛋白原平板。

斜面培養(yǎng)基（LB 固體培養(yǎng)基）：胰蛋白胨1.0 %、酵母提取物0.5 %、氯化鈉1.0 %、瓊脂1.5%～2.0%，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1 %，麥芽糖2.0 %，酵母提取物1.0 %，葡萄糖0.2%，蝦殼粉1.0%，脫脂牛奶2.0%，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，PBS，pH7.2）：將72.0 mL 0.2 mol/L 的Na2HPO4水溶液與28.0 mL 0.2 mol/L 的NaH2PO4水溶液混勻，配制成0.2 mol/L的PBS，121 ℃滅菌20 min。

工作液：將0.2 mol/L 的PBS 用無菌水稀釋成0.01 mol/L 的PBS，然后，準(zhǔn)確量取100.0 mL 與1700.0 mL 的0.9 %無菌生理鹽水混勻配制成工作液。

凝血酶溶液：將1240 U 的牛凝血酶加入到1.24 mL 無菌超純水中，充分溶解后配成母液。然后，準(zhǔn)確量取1.0 mL母液，用0.9%的無菌生理鹽水定容到100 mL 配制成10 U/mL，保藏于-20 ℃待用。

纖維蛋白原溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的牛血纖維蛋白原溶液溶于工作液中配制成1.50 mg/mL 的纖維蛋白原溶液。纖維蛋白原溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前，于55 ℃水浴中預(yù)熱1 min。

瓊脂糖溶液：準(zhǔn)確稱取5.40 g 瓊脂糖溶于360 mL 工作液中，分裝到20 支大試管中，每支分裝18 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 高產(chǎn)纖溶酶菌株的初篩

稱取5.00 g 中高溫大曲樣品，置于盛有45 mL無菌生理鹽水且底部鋪滿玻珠的250 mL 三角瓶中，80 ℃水浴處理10～15 min 后，180 r/min 振蕩搖勻30 min，獲得菌懸液。菌懸液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，取10-6、10-7、10-8的稀釋液0.2 mL，加入到無菌培養(yǎng)皿中。然后，將冷卻到50 ℃左右的初篩培養(yǎng)基注入到含有稀釋液的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪滿皿底即可，充分混勻后，靜置凝固15 min，于37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)皿中挑選菌落形態(tài)不同且水解圈較大的菌落，在初篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行連續(xù)劃線分離至純，挑取水解圈較大的單菌落，保藏到斜面培養(yǎng)基，編號(hào)為QM1～QM13。然后，將微生物在初篩培養(yǎng)基上分3 個(gè)區(qū)域接種，以37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察其菌落形態(tài)，并經(jīng)革蘭氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 高產(chǎn)纖溶酶菌株的復(fù)篩

1.2.3.1 纖溶酶粗酶液的制備

用接種環(huán)挑取2～3 環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌落到50 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下180 r/min 活化培養(yǎng)18 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌濃為1.0×108cfu/mL。然后吸取1 mL 接種到24 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃條件下180 r/min 培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液8000 r/min 冷凍離心（4 ℃）5 min，收集上清液獲得纖溶酶粗酶液。

1.2.3.2 瓊脂糖-纖維蛋白原平板的制備[11]

將裝有18 mL 1.5%瓊脂糖的試管放入沸水浴中使瓊脂糖完全溶解，冷卻至50～55 ℃。準(zhǔn)確加入2 mL 牛血纖維蛋白原溶液(1.50 mg/mL)，充分振蕩混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中（Φ：9 cm）。然后，迅速加入1 mL 牛凝血酶溶液(10 U/mL)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使其充分混勻，靜置1 h 后，用直徑2 mm 的無菌打孔器在平板上均勻打3個(gè)孔。

1.2.3.3 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

將尿激酶標(biāo)品用無菌水稀釋成1000 IU/mL、800 IU/mL、600 IU/mL、400 IU/mL、200 IU/mL 和100 IU/mL 等6 個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取10 μL尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，一個(gè)濃度做3個(gè)平行。然后，靜置吸附15～20 min，37 ℃培養(yǎng)18 h，從3 個(gè)方向用游標(biāo)卡尺測(cè)定溶解圈的直徑，取平均值計(jì)算各溶解圈面積（mm2）。以溶解圈的面積為橫坐標(biāo)（x），以尿激酶酶活為縱坐標(biāo)（y），制作尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.4 纖溶酶活力的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取10μL 纖溶酶粗酶液注入瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，一個(gè)濃度做3 個(gè)平行。然后，靜置吸附15～20 min，37 ℃培養(yǎng)18 h，從3 個(gè)方向用游標(biāo)卡尺測(cè)定溶解圈的直徑，取平均值計(jì)算各溶解圈面積，由尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算纖溶酶的活力。

1.2.4 高產(chǎn)纖溶酶菌株的鑒定

1.2.4.1 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

利用VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)纖溶酶活性較高的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定。具體流程如下：將纖溶酶活性較高的菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，用無菌接種環(huán)挑取菌體到裝有3 mL 的0.9 %無菌生理鹽水的小試管中，渦旋振蕩打散后，用無菌生理鹽水將菌濃調(diào)整到0.3～0.5 麥?zhǔn)蠞岫取Ｈ缓?，將小試管放到卡架上與VITEK-2 革蘭氏陽性芽孢桿菌鑒定卡連接，把卡架放入儀器填充室中進(jìn)行自動(dòng)填充并放入到培養(yǎng)室中培養(yǎng)檢測(cè)。最后，將鑒定卡信息錄入到VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)工作站，培養(yǎng)檢測(cè)14～15 h 后經(jīng)工作站導(dǎo)出生理生化反應(yīng)結(jié)果及最終的鑒定結(jié)果。

1.2.4.2 16S rDNA測(cè)序鑒定

為進(jìn)一步鑒定纖溶酶活性較高的菌株，將菌株接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h 后，10000 r/min 冷凍離心（4 ℃）10 min，去除上清液收集菌體。然后，用傳統(tǒng)DNA 提取方法提取微生物的基因組DNA[8]，經(jīng)核酸蛋白儀測(cè)定濃度及純度后移交上海生工生物工程有限公司測(cè)定16S rDNA 全長序列。

表1 分離的細(xì)菌的菌落形態(tài)

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Adobe Photoshop 軟件對(duì)菌落圖及革蘭氏染色圖進(jìn)行處理。使用OriginPro 9.0 軟件繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用SPSS statistics 19.0 軟件對(duì)不同菌株的纖溶酶活力進(jìn)行顯著性分析。菌株的16S rDNA 序列經(jīng)NCBI 網(wǎng)站Blast 功能檢索同源性序列，然后利用MEGA-X軟件作系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)纖溶酶菌株的初篩、菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

纖溶酶是一種絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶，可以水解初篩培養(yǎng)基中的酪蛋白形成水解圈[7，12]?；诖耍瑥闹懈邷卮笄谐醪胶Y得13 株酪蛋白水解活力較高的細(xì)菌，編號(hào)為QM1—QM13（表1）。將13 株細(xì)菌分別接種到初篩培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后觀察其菌落形態(tài)，如表1 所示，QM1、QM2、QM3、QM4、QM6、QM7、QM8、QM9 和QM10 的菌落形態(tài)一致，均為乳白色、圓形、邊緣整齊、顆粒感、致密、有褶皺突起、黏液少、不透明，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，可能為同一種細(xì)菌。QM5 的菌落形態(tài)為乳白色、邊緣不規(guī)則、顆粒感、不致密、褶皺凸起、黏液較多、不透明、與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密，可能為另一種細(xì)菌。QM11、QM12 和QM13 的菌落形態(tài)一致，與其他微生物的菌落形態(tài)差異明顯，為米白色、邊緣不規(guī)則、光滑、不致密、凸起、黏液很多、微透明，與培養(yǎng)基結(jié)合較緊密，可能為同一種細(xì)菌。部分細(xì)菌的菌落圖如圖1 所示。為進(jìn)一步研究各細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡下觀察其形態(tài)，如表2 所示。結(jié)果表明，篩得的細(xì)菌均為革蘭氏陽性芽孢桿菌、短桿、單聯(lián)或二聯(lián)，孢子為橢圓形中生孢子。部分微生物的革蘭氏染色圖如圖2所示。

圖1 分離的細(xì)菌的菌落形態(tài)圖

2.2 高產(chǎn)纖溶酶菌株的復(fù)篩

2.2.1 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同酶活梯度的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液在瓊脂糖-纖維蛋白原平板上反應(yīng)結(jié)束之后，以溶解圈直徑的平均值計(jì)算的面積為橫坐標(biāo)（x，mm2），以尿激酶酶活為縱坐標(biāo)（y，IU/mL），繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3 所示。擬合的線性回歸方程為y=0.1041x+5.9879，R2=0.9919，結(jié)果表明，方程線性關(guān)系良好，可用于纖溶酶活性的測(cè)定。

2.2.2 芽孢桿菌的纖溶酶活力

表2 分離的細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)

圖2 分離的細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)圖

圖3 尿激酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

將10 μL 纖溶酶粗酶液加入到瓊脂糖-纖維蛋白原平板孔中，培養(yǎng)至與尿激酶反應(yīng)時(shí)間一致后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定3 個(gè)平行的水解圈直徑，計(jì)算水解圈的面積。然后，經(jīng)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各纖溶酶粗酶液的纖溶酶活力（均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，IU/mL），如圖4 所示。結(jié)果表明，不同芽孢桿菌發(fā)酵液的纖溶酶活力差異顯著性（p＜0.05），QM12 和QM5的纖溶酶活力最高，分別為4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL和3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL，其次為QM4（3508.84 IU/mL±531.72 IU/mL），QM1 和QM7 的最低，分別為2379.71 IU/mL±69.38 IU/mL 和2447.82 IU/mL±53.79 IU/mL。目前，研究學(xué)者主要從納豆[13-14]、豆豉[15]、臭豆腐[11]、豆醬[16]、鷹嘴豆[17]和土壤[2，18]等微生態(tài)環(huán)境中篩選高產(chǎn)纖溶酶的菌株。但是，文獻(xiàn)中的纖溶酶活力的單位眾多，如FU/mL、U/mL、IU/mL、FU/g、U/mg、mU/mg 等[1，18]，難以比較不同菌株間的酶活力大小。酶活力單位為IU/mL的菌株的纖溶酶活力多為300～2100 IU/mL[19-24]，極少數(shù)菌株通過發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種或基因改造可使纖溶酶活力達(dá)到4000～5500 IU/mL[25-26]。本研究從中高溫大曲中篩選的芽孢桿菌的纖溶酶活力均＞2400 IU/mL，且為野生型菌株，未進(jìn)行培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化，表明篩選的芽孢桿菌為高產(chǎn)纖溶酶菌株，特別是QM5 和QM12。Nidialkova 等[7]指出芽孢桿菌合成的纖溶酶為絲氨酸及金屬肽酶，可以水解纖維蛋白、纖維蛋白原和合成的物質(zhì)，可在pH5～12 及10～75 ℃條件下保持活性。白酒中也檢出了一定含量的地衣素、脯氨酸-組氨酸-脯氨酸等的活性肽，表明這些物質(zhì)可經(jīng)過蒸餾進(jìn)入到白酒中，并保有一定的功能活性[9]。本試驗(yàn)從釀酒大曲中篩得纖溶酶活力較高的芽孢桿菌，有利于揭示白酒的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等養(yǎng)生保健作用，后續(xù)研究工作仍需要對(duì)這些纖溶酶的種類進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

圖4 分離的芽孢桿菌纖溶酶活力

2.3 高產(chǎn)纖溶酶芽孢桿菌的菌種鑒定

2.3.1 生理生化鑒定

VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)可有效對(duì)微生物進(jìn)行鑒定[27]，經(jīng)該方法對(duì)纖溶酶活力最高的兩株芽孢桿菌QM5 和QM12 進(jìn)行了鑒定，其生理生化反應(yīng)結(jié)果見表3。QM5 菌株的β-木糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶和丙酮酸鹽反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，而QM12 的則呈現(xiàn)陰性，其次，QM12 的L-賴氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、β-半乳糖苷酶、丙氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶、環(huán)糊精、糖元、己醇、ELLMAN、麥芽三糖、氨基酸芳胺酶、N-乙酰-D-葡萄糖氨、α-葡萄糖苷酶、D-塔格糖、紅四氮唑、多粘菌素B 耐受反應(yīng)呈現(xiàn)陽性，QM5 則呈現(xiàn)陰性。QM5 與QM12 的其他反應(yīng)結(jié)果一致。結(jié)果表明，QM5 和QM12 生理生化反應(yīng)差別明顯，為兩種不同的芽孢桿菌，與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。QM5 BCL 卡鑒定編碼為1260140415446220，結(jié)果為Bacillus amyloliquefaciens，為可接受的鑒定結(jié)果。QM12 BCL 卡鑒定編碼為2373271755076261，結(jié)果為Bacillus licheniformis，可信度達(dá)96 %，為很好的鑒定結(jié)果。

2.3.2 16S rRNA鑒定

為進(jìn)一步鑒定QM5 和QM12 的種屬，將基因組DNA 提取后，擴(kuò)增其16S rDNA 并進(jìn)行測(cè)序，分別得到片段長度為1394 bp 和1449 bp 的序列。經(jīng)NCBI BLAST 軟件搜索其在GenBank 中的同源性序列，結(jié)果表明，QM5 的16S rDNA 序列與Bacillus velezensis的同源性為99 %，QM12 的16S rDNA 序列與Bacillus licheniformis的同源性為100%。基于搜索的同源性序列，利用MEGA X 軟件的Neighbor-Joining 功能構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5。QM5 與Bacillus velezensis聚為一簇，相似性高達(dá)99%（圖5A），QM12 與Bacillus licheniformis聚為一簇，相似度高達(dá)100 %（圖5B）。Bacillus velezensis的基因與Bacillus amyloliquefaciens的基因相似度很高，曾被歸類同一種微生物[28]，可能是VITEK 2COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)將QM5 鑒定為Bacillus amyloliquefaciens的原因。最新的研究表明Bacillus velezensis與Bacillus amyloliquefaciens的ANI 和dDDH 值低于種水平的閾值，應(yīng)該保持各自的命名[29-30]。因此，結(jié)合VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)的鑒定及16S rDNA 測(cè)序結(jié)果，QM5 鑒定為Bacillus velezensis，QM12 鑒定為Bacillus licheniformis。

表3 QM5和QM12 在BCL鑒定卡上的生化反應(yīng)結(jié)果

圖5 菌株QM5和QM12的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究通過稀釋平板混菌法從瀘州老窖高溫大曲中分離純化得到13 株蛋白酶高產(chǎn)菌株QM1—QM13，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，均為革蘭氏陽性芽孢桿菌。將其接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，離心獲得粗酶液，由瓊脂糖-纖維蛋白原平板測(cè)定纖溶酶活性，獲得2 株纖溶酶活力較高的菌株QM5 和QM12，纖溶酶活力分別為3711.48 IU/mL±418.93 IU/mL 和4270.83 IU/mL±563.52 IU/mL，與已有的研究結(jié)果相比，其屬于纖溶酶高產(chǎn)菌株。結(jié)合VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、16S rDNA 全序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，QM5 為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），QM12 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。