梁紅霞,余志晟,*,劉如銦,張洪勛,吳 鋼

1 中國科學院大學資源與環(huán)境學院, 北京 100049 2 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085

近年來,家禽的出欄量和存欄量在我國所有畜禽中排第一位[1],這導致了大量禽類糞便的產(chǎn)生。大量的禽類糞便排入環(huán)境水體中,造成水質(zhì)的不斷惡化[2- 4]。將家禽糞便作為肥料用于土地中的事件也屢有報道,這也會增加土壤污染的風險[5]。而且,禽類糞便中攜帶的各種細菌和病毒也會威脅人類的身體健康[6-7]。禽類糞便可能會對水體和土壤環(huán)境以及人類健康造成的不利影響,因此快速準確的識別糞便污染并及時控制污染源對于環(huán)境保護和人類健康至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的糞便污染指示菌,如大腸桿菌、腸球菌等在人和溫血動物腸道微生物群落中為優(yōu)勢菌,因此常用于指示水質(zhì)狀況[8]。但是,它們在水體污染溯源檢測方面存在一定的局限性[9]。比如,對宿主特異性低導致不能準確指示污染來源[10-11],可以在體外繁殖而無法反映水體近期的污染情況等[12-13]。為了準確判斷糞便污染物的來源,研究人員利用人和動物胃腸道中的微生物設計出具有特異性的標記物以檢測糞便污染的來源,并稱之為微生物溯源技術(shù)(Microbial source tracking, MST)[14-15]。微生物溯源標記物開發(fā)的基本前提為,(1)糞便源指示微生物在特定的宿主腸道內(nèi)為優(yōu)勢菌且與宿主密切相關(guān)；(2)這些微生物存在宿主特異性序列且該序列可以設計為宿主糞便污染的標記物[16]。另外,指示標記物在排放環(huán)境中的賦存周期、行為也是需要考慮的因素[17]。

為了快速準確地檢測來自禽類糞便的污染以減少其對環(huán)境和人類健康的影響,針對不同禽類的糞便污染標記物已經(jīng)被開發(fā),包括家禽(如雞(Gallusgallus)[18]、鴨(Aixsponsa)[5]和鴿子(Columbalivia)[19])和野鳥(如加拿大雁(Brantacanadensis)[20]、海鷗(Laruscanus)[3]和沙丘鶴(Gruscanadensis)[21]等)。但是,隨著禽類標記物種類和數(shù)目的增加,研究人員難以快速準確地選擇出指示效果最好的禽類標記物用于糞便污染的檢測。本文在前人研究基礎上,對禽類微生物溯源標記物的開發(fā)和研究進展進行歸納和總結(jié),為禽類標記物的快速選擇提供一定的理論支持,為禽類微生物溯源技術(shù)在我國的發(fā)展和應用提供參考。

1 禽類微生物溯源標記物的性能評價

目前,多種禽類標記物已經(jīng)被設計用于檢測來自家禽(如雞、鴨和鴿子等)和野鳥(如海鷗、加拿大雁和沙丘鶴等)的糞便污染(表1)。禽類標記物可分為通用標記物和特異性標記物,通用標記物用于檢測所有禽類的糞便污染,而特異性標記物用于特定禽類的檢測。一般地,可使用敏感性(Sensitivity)和特異性(Specificity)來衡量標記物的指示效果[14]。敏感性指標記物在目標宿主糞便樣品中的陽性率；特異性指標記物在非目標宿主糞便樣品中的陰性率。敏感性和特異性的數(shù)值越大,表明該標記物的指示效果越可信。敏感性和特異性的計算公式如下：

(1)

(2)

式中,TP(True positive)指標記物顯示陽性的目標宿主糞便樣品的數(shù)量；FN(False negative)指標記物顯示陰性的目標宿主糞便樣品的數(shù)量；TN(True negative)指標記物顯示陰性的非目標宿主糞便樣品的數(shù)量；FP(False positive)指標記物顯示陽性的非目標宿主糞便樣品的數(shù)量。

表1 家禽和野鳥的微生物溯源標記物

2 禽類微生物溯源標記物的發(fā)展

禽類微生物溯源標記物的設計來源主要為細菌16S rRNA基因、線粒體DNA和功能基因等(圖1)。以細菌16S rRNA基因為設計來源的分子標記物具有廣泛的應用,但有些禽類特別是野鳥會隨季節(jié)的變化發(fā)生遷徙,其腸道微生物組成隨宿主地理位置的變化而變化,使得設計出的標記物在不同區(qū)域的指示效果存在差別；線粒體DNA設計的禽類標記物多表現(xiàn)出高敏感性和高特異性的特征,且受宿主所在地理區(qū)域的影響較小,可廣泛用于禽類的微生物溯源研究；盡管目前基于功能基因設計出的禽類標記物指示效果較差,但是使用功能基因設計禽類標記物的思路值得參考和借鑒。

2.1 細菌16S rRNA基因

在禽類微生物溯源研究中,最常使用的細菌是厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌目(Bacteroidales)及其家族成員,其次是放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)及其家族成員。此外,也有一些種屬信息尚未確定的源指示菌的16S rRNA基因用于禽類分子標記物的開發(fā),如E2[33]和AV216[23]等。

2.1.1厚壁菌門及其家族成員

厚壁菌門及其家族成員在禽類的糞便樣品中具有較高的相對豐度[23, 36]。Ohad等[23]基于家禽和水鳥糞便樣品的16S rRNA基因高通量測序數(shù)據(jù),針對在門水平上相對豐度為94%的厚壁菌設計出高特異性(99%)的禽類通用標記物AV43；針對在科水平上相對豐度為90%的乳酸桿菌(Lactobacillus)設計出敏感性和特異性分別為93%和97%的禽類通用標記物AV4143。

Catellicoccusmarimammalium屬于腸球菌科(Enterococcaceae)。有研究表明C.marimammalium為海鷗糞便微生物群落中的優(yōu)勢菌,且在海鷗糞便中存在特異性序列[3]。研究人員基于C.marimammalium16S rRNA基因開發(fā)出的海鷗標記物Gull2[3]、Gull4[34]和Sketa[2],其敏感性和特異性均分別在71%和91%以上。但是,利用同屬于厚壁菌門的鏈球菌(Streptococcusspp.)16S rRNA基因設計出的海鷗標記物Gull3,其敏感性僅為28%[34]。Green等[22]根據(jù)C.marimammalium16S rRNA基因開發(fā)的禽類通用標記物GFC,在64%的海鷗糞便樣品中檢出,但在其他禽類樣品中的陽性率均不足5%。因此,C.marimammalium16S rRNA基因設計的標記物對海鷗表現(xiàn)出較高的宿主特異性,能夠用于海鷗的微生物溯源研究中。

柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)屬于瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)。因其嚴格厭氧,在體外不能繁殖且存活周期短的特點逐漸用于糞便污染研究中[37]。Shen等[30]通過比較不同動物糞便中的柔嫩梭菌屬16S rRNA基因,在雞糞便中發(fā)現(xiàn)一段特異性序列,并據(jù)此設計出敏感性和特異性分別為76%和100%的雞糞源標記物IVS-p。另外,柔嫩梭菌屬通用標記物和特異性標記物對雞糞便污染的檢測在我國珠江三角洲地區(qū)都得到了很好的驗證[37-38]。目前,美國政府機構(gòu)已經(jīng)把Faecalibateriu檢測方法納入飲用水的輔助檢測項目之中[39],說明柔嫩梭菌屬在水質(zhì)監(jiān)測中的應用正逐漸受到重視。

圖1 禽類微生物溯源標記物的分類Fig.1 Classification of avian markers for microbial source tracking

2.1.2擬桿菌目及其家族成員

擬桿菌(Bacteroides)是人和溫血動物糞便微生物中的優(yōu)勢菌,其16S rRNA基因經(jīng)常被用于設計人、哺乳動物和反芻動物的微生物溯源分子標記物[14],也有研究者將擬桿菌用于雞[18]、鴨[18]和加拿大雁[20]等禽類微生物溯源研究中。但是,擬桿菌標記物在禽類微生物溯源研究中的指示效果一般,如在加拿大雁糞便樣品中的敏感性低于60%[20],在雞糞便中的檢出率也低于75%[18, 25]。

擬桿菌在禽類糞便污染研究中指示效果差的原因可能如下, (1)擬桿菌在不同種類禽類的糞便微生物相對豐度差異較大,使得擬桿菌禽類通用標記物的設計很困難。Ohad等[23]發(fā)現(xiàn)擬桿菌在母雞糞便細菌群落中的相對豐度為9.56%,但在水鳥中僅為0.1%；(2)擬桿菌在有些禽類腸道微生物群落并不是優(yōu)勢菌。有研究表明擬桿菌在部分禽類腸道和排泄物樣品中幾乎不存在,如水鳥[23]和海鷗[3]等。 Nshimyimana等[40]在新加坡的研究發(fā)現(xiàn),通用擬桿菌標記物BacUni在人和哺乳動物糞便樣品均有檢出,但在鳥類糞便中均表現(xiàn)為陰性?？傊?擬桿菌并不能準確地指示來自禽類的糞便污染。

2.1.3放線菌門、變形菌門和梭桿菌門及其家族成員

短桿菌(Brevibacterium)屬于放線菌門,短桿菌科(Brevibacteriaceae)。Lu等[41]發(fā)現(xiàn)短桿菌在雞墊料中為優(yōu)勢菌,且該菌暫未在其他禽類,如海鷗[41]、雪雁[21]和沙丘鶴[21]等糞便樣品中發(fā)現(xiàn)。研究者利用短桿菌在雞糞便中的16S rRNA特異性基因開發(fā)出雞糞源標記物CL-TaqMan[28]和LA35[29]。Ryu等[28]使用雞墊料和糞便樣品對這兩種標記物的指示效果進行測試,發(fā)現(xiàn)LA35和CL-TaqMan的敏感性在雞糞便樣品中均≤23%,但在雞墊料樣品中均≥98%。有研究報道雞糞便和墊料樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)存在差異[41-42],短桿菌屬在雞墊料樣品是相對豐度最高的菌屬之一[43],但在雞的糞便和腸道樣品中不存在或者少量存在[44-45],這可能解釋了LA35和CL-TaqMan 在雞墊料和糞便樣品中的檢出差異?？傊?利用短桿菌屬16S rRNA基因開發(fā)出的這兩種標記物能夠很好地指示雞墊料的污染。

禽類通用標記物AV163[23]和GFD[22]分別由變形菌門分類下的卡氏桿菌屬(Gallibacterium)和幽門螺旋桿菌屬(Helicobacter)16S rRNA基因設計而來。其中,標記物GFD在中國、美國、新西蘭和澳大利亞等多個國家進行過溯源研究[22, 46-47],但該標記物在不同國家的指示效果有所不同。比如,在美國的糞便樣品中顯示30%的敏感性[47],而在中國顯示70%的敏感性[46]。對于在不同區(qū)域敏感性表現(xiàn)不同的標記物,使用前應進行預實驗以判斷其在本地的適用性。

圖2 線粒體DNA的基本分子結(jié)構(gòu)[48]Fig.2 The basic molecular structure of mitochondrial DNA[48]

禽類通用標記物GFB[22]、AV13[23]和AV24[23]均來自梭桿菌科(Fusobacteriaceae)16S rRNA基因。在引物設計者的研究中[22-23],這3個標記物的特異性均為100%,但是它們的敏感性均低于10%,或許其所對應的基因序列在禽類糞便微生物中相對豐度較低。總之,這些標記物不適用于禽類的微生物溯源研究中。

2.2 線粒體DNA

人類和動物腸道上皮細胞在腸道內(nèi)脫落的過程中,腸道上皮細胞中的線粒體DNA會隨腸道內(nèi)容物以糞便的形式排出體外,所以人和動物糞便中均含有大量的線粒體DNA[48-49]。另外,線粒體DNA對宿主具有高度特異性[50-51],因此其逐漸運用于糞便污染溯源研究中[52- 54]。2005年,Martellini等[55]將線粒體DNA首次用于糞便污染微生物溯源中,實現(xiàn)了流域污染源的快速判斷。

在禽類微生物溯源研究中,線粒體DNA的cytb基因常用于設計禽類標記物,其次是ND5基因、16S rRNA基因和ND2基因(圖2)。Zhuang等[24]分別利用線粒體ND5和cytb基因開發(fā)出雞和鴨糞便污染標記物,且設計出的標記物敏感性和特異性分別達到100%和≥85%,表現(xiàn)出良好的指示效果。Kortbaoui等[27]使用巢式PCR技術(shù)對線粒體16S rRNA基因設計的雞糞源標記物進行指示效果評估,結(jié)果表明該標記物的特異性和敏感性均達到100%。

禽類特別是野鳥因季節(jié)性遷徙或覓食等因素,不會在同一區(qū)域長期停留。有研究表明飲食的改變和地理區(qū)域的差異會顯著影響動物的腸道微生物群落組成[56-57],禽類所處的高度多樣性的環(huán)境可能會影響其腸道微生物組成,使得禽類微生物溯源標記物的發(fā)展存在一定困難。但是,許多研究表明線粒體DNA不易受宿主的飲食狀況和所在地理區(qū)域的影響[35, 50]。Liang等[58]使用中國5個不同區(qū)域的糞便樣品對已有雞源標記物進行系統(tǒng)評估后發(fā)現(xiàn),以線粒體DNA為設計來源的雞源標記物表現(xiàn)出最好的指示效果。本文歸納總結(jié)的標記物中(表1),利用線粒體DNA開發(fā)出的禽類標記物大多表現(xiàn)出高敏感性和特異性,所以線粒體DNA比細菌16S rRNA基因更適用于禽類微生物溯源標記物的開發(fā)。

2.3 功能基因

有研究表明與細胞有關(guān)的功能基因是宿主特異性實驗的良好標記物[59],所以功能基因也能應用到糞便微生物溯源研究中。樊麗華等[60]發(fā)現(xiàn)能夠編碼某些細菌表面蛋白、膜分泌蛋白及碳水化合物代謝蛋白的相關(guān)基因可作為豬特異性分子標記物設計的目標序列。

在禽類微生物溯源中,也有將功能基因作為特異性標記物的相關(guān)研究。Lu等[32]利用與細胞新陳代謝,細胞進程和信息的儲存與處理等有關(guān)的基因設計禽類特異性標記物。比如,部分標記物對應的基因與新陳代謝有關(guān),這些基因負責編碼的細胞膜功能蛋白參與運輸營養(yǎng)物質(zhì),包括碳水化合物(CP1- 26)、無機離子(CP1- 24 和 CP2- 9)和氨基酸(CP1- 55和CP3- 49)等。Hamilton等[61]基于宏基因組數(shù)據(jù)開發(fā)出加拿大雁特異性標記物GB2和GE11,這些標記物對應的基因負責編碼粘附素細菌表面蛋白,該蛋白能夠介導細菌對上皮細胞粘附、侵襲、細菌的自動聚集和生物膜的形成[62],為細菌在宿主腸道內(nèi)的定殖起關(guān)鍵作用。

已開發(fā)的功能基因標記物對宿主的敏感性普遍較低。Lu等[32]利用21種動物的糞便樣品對功能基因標記物的性能進行測試。在測試的雞糞源標記物中,效果最好的標記物為CP2- 9,其敏感性僅為40%。Hamilton等[61]使用135份加拿大雁樣品對標記物的敏感性測試,結(jié)果表明其敏感性均在20.7%到48.1%之間。雖然這些禽類功能基因標記物的敏感性較低,但是將功能基因設計為禽類標記物的研究思路具有很大的參考價值。

3 總結(jié)與展望

近年來,禽類微生物溯源的研究已經(jīng)取得了很大的進展,針對家禽(如雞、鴨和鴿子)和野鳥(如海鷗、加拿大雁和沙丘鶴)均設計出了相應的標記物。部分細菌16S rRNA基因標記物表現(xiàn)良好,如禽類標記物AV4143[23]和海鷗標記物Sketa[2]等；線粒體DNA不受宿主飲食和地理環(huán)境的影響,其對應的標記物大都表現(xiàn)出較高的敏感性和特異性,可重點用于禽類標記物的開發(fā)；利用功能基因進行標記物的設計也為禽類微生物溯源研究提供了新思路。

但是,禽類微生物溯源仍然面臨較大的挑戰(zhàn)。(1)許多禽類標記物并不是在我國發(fā)展而來,這些標記物在我國的指示效果并不可知,因此需要將現(xiàn)有禽類標記物在我國進行系統(tǒng)的比較以選擇指示效果較好的標記物。(2)現(xiàn)有禽類標記物多表現(xiàn)為敏感性較低,所以應設計更多禽類標記物以準確檢測禽類糞便污染。(3)現(xiàn)有溯源技術(shù)手段多表現(xiàn)為低通量,可將高通量數(shù)據(jù)溯源分析平臺(如SourceTracker[63]和FEAST[64]等)應用到禽類糞便污染檢測中。

致謝：中國科學院大學王波波博士幫助寫作,特此致謝。