高 鋒，何明霞，劉 靜，方藝偉，楊天偉，許欣景，王文兵，王 云，張春霞

（云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus portentosus） 是牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus） 的一種珍稀食用菌，俗稱黑牛肝菌，國內(nèi)主要分布于云南、廣西、海南和四川；國外主要分布于泰國和斯里蘭卡[1]。同時，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌是西雙版納市場上深受人們喜愛的一種有營養(yǎng)，經(jīng)濟價值高，且味道鮮美的珍稀食用菌[2]。

野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌由于受到掠奪性地采收，市場供應量逐年遞減。2003年以來系統(tǒng)地進行了暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的栽培技術研究[2-4]，目前其人工栽培專利已成功轉(zhuǎn)讓給企業(yè)進行工廠化周年栽培[5-7]；仿生栽培技術也相繼獲得成功[8-9]，并已向部分農(nóng)戶推廣。無論是工廠化栽培還是仿生栽培，目前所用的優(yōu)良菌株主要是通過組織分離野生及仿生栽培的子實體，再經(jīng)過出菇試驗篩選獲得[10-11]。由于優(yōu)良菌株傳代一定次數(shù)后會發(fā)生退化[19]，因此科學有效地保護暗褐網(wǎng)柄牛肝菌野生資源對該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展至關重要。

同工酶是催化相同反應而結(jié)構和理化性質(zhì)不同的一類酶[12]，同工酶分析是從蛋白質(zhì)水平上研究生物群體遺傳分化的重要手段之一[12-14]。對酯酶同工酶酶譜的相似性系數(shù)進行聚類分析已廣泛用于研究食用菌菌株的親緣關系和遺傳分化[15-16]，也用于選擇雜交親本、預測雜交優(yōu)勢[17]和鑒定雜交菌株[18]的研究。為了系統(tǒng)地評估暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的遺傳多樣性，從云南、四川兩省的9個采樣地共收集31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體并通過組織分離獲得了其菌株，分別利用固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種方式獲得其菌絲體，并對其進行酯酶同工酶分析，通過酶譜聚類分析研究分離菌株的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 子實體采集

野生子實體采集信息見表1，來源于同一采集地子實體的組織分離菌株為一個群體。

表1 子實體采集信息Tab.1 Information of sampled Phlebopus portentosus isolates

1.2 培養(yǎng)基

M1液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯（煮汁） 200 g、葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO41 g，蒸餾水定容至1 L[19]。

M1固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯（煮汁） 200 g、葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g、KH2PO41 g、瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L[19]。

1.3 試劑

Blue Plus?Protein Marker（1.4×104～1.0×105），北京全式金生物技術有限公司；Precast-Glgel 10%預制膠、改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒及其他分析純試劑，上海生工生物工程股份有限公司。

1.4 儀器

BIC-250人工氣候箱，上海博迅實業(yè)有限公司；SK-100B恒溫搖床，上海蘇坤實業(yè)有限公司；DYCZ-24DN雙垂直電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.5 菌株分離和保藏

選取新鮮、實心、菌管尚未開放的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實體，切去菌柄底部的泥沙，在超凈工作臺上，挑取菌柄與菌蓋交界部位約0.5 cm×0.5 cm組織塊，置于試管中M1固體培養(yǎng)基斜面上，在28℃～30℃條件下避光培養(yǎng)30 d。切取約50 mm2菌絲塊，置于裝有5 m無菌蒸餾水的15 mL塑料管中，15℃避光保存于云南省熱帶作物科學研究所。

1.6 酯酶同工酶電泳

1.6.1 菌絲體培養(yǎng)

固體培養(yǎng)菌絲體：挑取菌絲塊（直徑1 cm）接種于M1固體培養(yǎng)基平板上，于30℃避光培養(yǎng)7 d，在菌絲尖端切取1個菌絲塊（直徑1 cm） 接種于另一個平板中央，30℃避光培養(yǎng)18 d。

液體培養(yǎng)菌絲體：挑取菌絲塊（直徑1 cm） 接種于M1固體培養(yǎng)基平板上，于30℃避光培養(yǎng)7 d，無菌操作用手術刀將菌絲尖端挑取的10個菌絲塊（直徑1 cm） 切碎，轉(zhuǎn)至裝有400 mL M1液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。

1.6.2 酯酶同工酶電泳

樣品制備、電泳及染色分析參照高鋒等[19-20]的方法。根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的相對分子質(zhì)量及各條帶的相對遷移率，利用Microsoft Excel 2019擬合出標準曲線，用AlphaView SA3.4.0軟件計算各菌株酯酶同工酶的相對遷移率及相對分子質(zhì)量。

1.7 聚類分析

為了分析菌株間的親緣關系，參照Sneath等[21]的方法計算相似性系數(shù)（S），公式為：

式中：a為A菌株條帶數(shù)；b為B菌株條帶數(shù)；c為A菌株、B菌株共有條帶數(shù)。

先用SPSS 20.0軟件中的Jaccard相似性計算出菌株間的酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)（S）矩陣，再將該矩陣換算為距離（D=1-S） 矩陣，最后用MEGA X軟件的類平均連鎖法（UPGMA） 對各菌株酯酶同工酶酶譜進行聚類分析[22]。鑒于同一菌株2種培養(yǎng)方式的酯酶同工酶酶譜存在較大差異，單一培養(yǎng)方式有部分酯酶同工酶未誘導出，因此，將2種培養(yǎng)方式的酶譜合并后進行聚類分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶電泳結(jié)果

部分液體及固體培養(yǎng)的菌絲體酯酶同工酶電泳圖見圖1、圖2。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌酯酶同工酶條帶統(tǒng)計見表2。

圖1 部分液體培養(yǎng)菌絲體酯酶同工酶電泳圖Fig.1 Electrophoretic zymogram of esterase isozymes of mycelia cultured in liquid medium

圖2 部分固體培養(yǎng)菌絲體酯酶同工酶電泳圖Fig.2 Electrophoretic zymogram of esterase isozymes of mycelia cultured on solid medium

如圖1、圖2所示，暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株酯酶同工酶條帶類型有4種：深色寬、深色窄、淺色寬和淺色窄；根據(jù)蛋白Marker確定各條帶的相對分子質(zhì)量及相對遷移率，擬合出標準曲線（R2=0.997）方程為：

式中：y為相對分子質(zhì)量；x為相對遷移率（Rf）。

如表2所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株固體培養(yǎng)的菌絲體共檢出10條酯酶同工酶條帶，其中，Rf為 0.13、0.48、0.55和0.65的條帶出現(xiàn)頻率較高，各菌株分別具有2條～5條酯酶同工酶條帶，共檢出21種酶譜類型；液體培養(yǎng)的菌絲體共檢出11條酯酶同工酶條帶，Rf為0.13、0.55、0.38、0.65和0.75的條帶出現(xiàn)頻率較高，各菌株分別具有2條～6條酯酶同工酶條帶，共檢出23種酶譜類型。2種培養(yǎng)方式下所有菌株均檢出一條Rf為0.13、相對分子質(zhì)量為136 kDa的酯酶同工酶條帶。不同培養(yǎng)方式酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)見表3。

表3 不同培養(yǎng)方式酯酶同工酶酶譜相似性系數(shù)Tab.3 Similarity coefficient of esterase isozymes in different medium of the same strain

如表3所示，不同培養(yǎng)方式下，同一菌株的酶譜也存在不同程度的差異，相似性系數(shù)介于0.143～1.000，除了MHDL5、HHKY1和JHSC1的相似性系數(shù)大于等于0.500外，其他28個菌株的相似性系數(shù)均小于0.500。31個菌株中，液體培養(yǎng)菌株的酯酶同工酶條帶數(shù)與固體培養(yǎng)的比值大于1的菌株有19個，等于1的有8個，小于1的有4個，可見液體培養(yǎng)菌株的酯酶同工酶條帶數(shù)普遍多于固體培養(yǎng)。

2.2 酯酶同工酶酶譜聚類分析結(jié)果

2.2.1 液體培養(yǎng)菌株聚類分析結(jié)果

液體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果見圖3。

圖3 液體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果Fig.3 Cluster analysis of esterase isozyme zymogram of mycelia cultured in liquid medium

如圖3所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株液體培養(yǎng)菌絲體的酶譜相似性系數(shù)為0.111～1.000，遺傳距離為0～0.889。31個菌株在遺傳距離為0.150、0.220和 0.290時，分別聚為 13（1～13） 類、7（a～g） 類和4（I～IV） 類。在遺傳距離為0.150時，除HHGJ、JHDF、MY群體的菌株分別聚在同一分支外，其他群體的菌株聚在不同分支。

2.2.2 固體培養(yǎng)菌株聚類分析結(jié)果

固體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果見圖4。

如圖4所示，31個暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株固體培養(yǎng)的菌絲體酶譜相似性系數(shù)為0.125～1.000，遺傳距離為0～0.875。31個菌株在遺傳距離為0.130、0.225和0.300時，分別聚為16（1～16）類、9（a～i）類和4（I～IV） 類。在遺傳距離為0.130時，只有MY群體的2個菌株聚在同一分支，其他群體的菌株聚在不同分支。

圖4 固體培養(yǎng)菌株酯酶同工酶酶譜聚類結(jié)果Fig.4 Cluster analysis of esterase isozyme zymogram of mycelia cultured on solid medium

2.2.3 兩種培養(yǎng)方式菌株聯(lián)合聚類分析結(jié)果

2種培養(yǎng)方式菌株酯酶同工酶酶譜聯(lián)合聚類結(jié)果見圖5。

如圖5所示，2種培養(yǎng)方式菌株的酶譜進行聯(lián)合聚類分析的相似性系數(shù)為0.083～1.000，遺傳距離為0～0.917。31個菌株在遺傳距離為0.160、0.245和 0.280時，分別聚為 13（1～13） 類、7（a～g） 類和4（I～IV） 類。在遺傳距離為0.160時，只有MY群體的2個菌株聚在同一分支，其他群體的菌株聚在不同分支。

圖5 兩種培養(yǎng)方式菌株酯酶同工酶酶譜聯(lián)合聚類結(jié)果Fig.5 Combination cluster analysis of esterase isozyme zymogram of solid and liquid media cultured mycelium

3 討論

多項研究利用酯酶同工酶技術分析野生食用菌菌株的遺傳多樣性以及與地理分布的相關性。王一等[23]研究發(fā)現(xiàn)來源于川西高原的113個蘑菇（Agaricus campestris） 菌株在相似系數(shù)為0.50時，分為5大類群，但聚類結(jié)果與采集地的地理位置相關性不強。郭金英等[24]研究發(fā)現(xiàn)采自神農(nóng)架的40個野生香菇（Lentinula edodes） 菌株分別具有5條～8條酯酶同工酶條帶，在遺傳相似系數(shù)約0.71時，分為7個類群。翟玉[25]研究發(fā)現(xiàn)，除個別菌株外，采自云南省及周邊的黑木耳（Auricularia auricular）菌株與東北地區(qū)的菌株分別聚在不同的分支上。吳圣進等[16]研究發(fā)現(xiàn)廣西百色地區(qū)采集的23個野生黑木耳菌株在遺傳相似系數(shù)為0.68時，分為兩大類群，大部分菌株聚類結(jié)果與地理位置相關。本研究發(fā)現(xiàn)基于酯酶同工酶酶譜的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株聚類結(jié)果與地理來源無相關性，這與多年的生態(tài)調(diào)查相吻合。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌在國內(nèi)主要分布在公園、果園、苗圃中，在原始森林中極少發(fā)現(xiàn)，推測其可能隨著宿主植物的引種、移栽發(fā)生了人為傳播，因此各地域間的菌株未能形成有效的地理隔離。

研究表明，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件對食用菌酯酶同工酶的表達具有一定的影響。梁建光等[26]分別從培養(yǎng)第7天、第11天、第14天的糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 菌絲體中檢出10條、15條、13條酯酶同工酶條帶；在4種不同培養(yǎng)基（I～IV） 培養(yǎng)的菌絲體中分別檢出5條、6條、11條、3條酯酶同工酶條帶，其中培養(yǎng)基III與IV培養(yǎng)的菌絲體之間的酶譜相似性系數(shù)僅為0.273。吳康云等[27]從培養(yǎng)10 d的黑木耳單核菌株J3和H2中分別檢出3條、6條酯酶同工酶酶條帶，培養(yǎng)30 d時2個菌株均缺少Rf為0.673的條帶。李守勉等[28]發(fā)現(xiàn)刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngii）2號菌株在培養(yǎng)至第5天時具有Rf為0.200和0.345的2個酯酶同工酶條帶，第7天時增加Rf為0.455的條帶，9 d～15 d時增加Rf為0.873和0.945的2條條帶。宗立立等[29]從PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的滑菇（Pholiota nameko） C31菌株菌絲體中檢出8個酯酶同工酶條帶，而PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)時只檢出7條，兩者相似性系數(shù)為0.875。本研究中菌絲體液體培養(yǎng)時間為7 d，固體培養(yǎng)時間為18 d，相同菌株不同培養(yǎng)方式的酶譜相似性系數(shù)均小于0.500，2種培養(yǎng)方式酶譜的聯(lián)合聚類分析結(jié)果表明暗褐網(wǎng)柄牛肝菌具有豐富的遺傳多樣性。近年來，分子生物學技術廣泛用于食用菌遺傳多樣性研究[30-32]，后續(xù)試驗將進一步增加暗褐網(wǎng)柄牛肝菌采集地數(shù)量，盡可能覆蓋其主要分布區(qū)域并適當增加分離菌株數(shù)，利用SSR、ISSR、RAPD、ITS等分子標記研究其遺傳多樣性，為后續(xù)種質(zhì)資源保護、種性鑒定、優(yōu)良菌株選育及菌種管理等提供參考。