唐 敏，丁 野，楊 陽(yáng)，謝孟樂(lè)，王淑敏，陳長(zhǎng)寶，王 歡，**，李 玉**

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，人參化學(xué)與藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130117；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 570100）

粗毛纖孔菌 [Inonotus hispidus (Bull.:Fr.) P.Karst.]，屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota） 傘菌綱（A-garicomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科 （Hymenochaetaceae） 纖孔菌屬 （Inonotus）[1]。粗毛纖孔菌具有極高的藥用價(jià)值，國(guó)內(nèi)多用于治療消化不良[2]、胃潰瘍[3]等，國(guó)外主要用其潤(rùn)腸通便的功效[4]。王婷等[5]的研究證明了粗毛纖孔菌粗多糖對(duì)H22荷瘤小鼠具有一定的抗腫瘤活性，此外，粗毛纖孔菌還可用于治療糖尿病、痛風(fēng)和關(guān)節(jié)炎等病癥[6]；粗毛纖孔菌子實(shí)體萃取物還具有調(diào)節(jié)人體免疫力[7]、抗病毒[8]、降血脂[9]等作用。

當(dāng)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡時(shí)，會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。體內(nèi)血糖濃度過(guò)高時(shí)，過(guò)量的活性氧ROS等會(huì)造成機(jī)體損傷進(jìn)而引起糖尿病及其并發(fā)癥[10]。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)（IDF） 報(bào)道，2017年全世界約有4.25億糖尿病患者，每年約有11%的人死于糖尿病及其并發(fā)癥[11]。α-葡萄糖苷酶抑制劑可用于調(diào)節(jié)血糖代謝，有效預(yù)防糖尿病及血管并發(fā)癥等[12]。臨床現(xiàn)有的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物，如阿卡波糖和伏格列波糖等對(duì)糖尿病具有較好的治療效果，但也會(huì)導(dǎo)致人體肝、腎組織的不可逆損傷[13]及出現(xiàn)腸胃脹氣、腹瀉、腹部不適等副作用[14]。從藥用真菌資源中挖掘具有抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制作用的天然藥物具有重要的意義。因此，本研究對(duì)粗毛纖孔菌子實(shí)體4種不同極性萃取物的總酚含量、α-葡萄糖苷酶抑制作用及體外抗氧化能力進(jìn)行了測(cè)定，為開(kāi)發(fā)高效低毒生物降血糖、抗糖尿病藥物及保健品提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

粗毛纖孔菌（I.hispidus） 采集于吉林省延吉市八家子鎮(zhèn)泉水洞林場(chǎng)，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定，其子實(shí)體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 粗毛纖孔菌子實(shí)體Fig.1 The fruiting body of Inonotus hispidus

由圖1可知，粗毛纖孔菌子實(shí)體，無(wú)柄，革質(zhì)至軟木栓質(zhì)。菌蓋平展，外伸可達(dá)22 cm，寬可達(dá)29 cm，基部厚可達(dá)5 cm；表面呈淺褐色，生長(zhǎng)活躍時(shí)呈金黃褐色，成熟時(shí)呈暗褐色，被粗毛，邊緣鈍。孔口表面褐色至暗褐色，多角形，每毫米2個(gè)～3個(gè)；管口邊緣薄，撕裂狀。不育邊緣明顯，寬可達(dá)3 mm。菌肉暗栗褐色，厚可達(dá)3 cm。菌管與孔口表面同色，長(zhǎng)可達(dá)35 mm[15]。

1.2 主要試劑

沒(méi)食子酸、α-葡萄糖苷酶、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚 （BHT）、2，4，6-三吡啶基 （TPTZ）、2，2-聯(lián)氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸） 二銨鹽（ABTS）、福林酚，購(gòu)自上海源葉生物有限公司；三氯化鐵、醋酸銨、甲醇、二甲基亞砜（DMSO）、過(guò)硫酸鉀，三氯乙酸和硫酸亞鐵等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；4-硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），純度≥99%，為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 主要設(shè)備

M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；EYELA N1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA OSB2200油浴鍋，東京理化器械（株）獨(dú)資工廠；BT25s電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵，上海瑞茲儀器設(shè)備有限公司；A11BS025粉碎機(jī)，德國(guó)IKA。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 供試樣品制備

取粗毛纖孔菌子實(shí)體130 g，粉碎后過(guò)100目篩，經(jīng)1.2倍體積甲醇連續(xù)提取3次，每次24 h，過(guò)濾后合并3次提取液，減壓濃縮，得到甲醇粗提物26.8 g。將甲醇粗提物溶解，按極性由小到大順序依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每個(gè)極性分別萃取3次，合并各極性萃取液，減壓濃縮，即得4個(gè)不同極性供試樣品。將供試樣品的濃度分別稀釋為 15.625 μg·mL-1、31.250 μg·mL-1、62.500 μg·mL-1、125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制作用及抗氧化能力測(cè)定。

1.4.2 總酚含量測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[16]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)Folin-Ciocalteu比色法原理，測(cè)定4種不同極性萃取物的總酚含量。將各極性萃取物的終濃度配制為1 000 μg·mL-1，以樣品溶液代替沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定在波長(zhǎng)750 nm下的吸光值。

1.4.3 α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[17]，稍作修改進(jìn)行測(cè)定。用pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液（含1%的二甲基亞砜溶液）配置樣品溶液，測(cè)定在波長(zhǎng)405 nm下的吸光值。以PBS（含1%的DMSO溶液） 為空白對(duì)照組，計(jì)算4種不同極性萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率（R1，%），公式為：

式中：Ax為樣品吸光值；Ax0為樣品本底吸光值；Ab為對(duì)照吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.4 DPPH清除能力測(cè)定

DPPH是一種較穩(wěn)定的自由基，溶于有機(jī)溶劑呈紫色，當(dāng)有自由基清除劑類的物質(zhì)存在時(shí)，DPPH自由基接受電子使溶液褪色，不同清除能力的物質(zhì)會(huì)使溶液顏色產(chǎn)生變化，并使最大紫外吸收處的吸收值產(chǎn)生差異[18]。

按照參考文獻(xiàn)[19]，測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)517 nm下的吸光值。以甲醇代替樣品為空白組，以同濃度的2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT） 為陽(yáng)性對(duì)照組。DPPH自由基清除率（R2，%） 計(jì)算公式為：

式中：AX為樣品吸光值；AX0為顯色劑本底吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.5 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參考Li等[20]的方法進(jìn)行ABTS自由基清除能力的測(cè)定。測(cè)定各反應(yīng)液在波長(zhǎng)734 nm下的吸光值。以甲醇代替樣品為空白組，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照組。ABTS自由基清除率（R3，%）計(jì)算公式為：

式中：AX為樣品吸光值；AX0為顯色劑本底吸光值；A0為空白吸光值。

1.4.6 總抗氧化能力測(cè)定

在酸性條件下，F(xiàn)e3+可被樣品中還原物質(zhì)還原為Fe2+的價(jià)態(tài)，在波長(zhǎng)593 nm下具有最大紫外吸收。根據(jù)氧化還原反應(yīng)的比色法原理，將樣品的吸光值換算為硫酸亞鐵的濃度進(jìn)行比較。

按照參考文獻(xiàn)[21]，配制FRAP工作液及硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品的抗氧化能力以硫酸亞鐵當(dāng)量（mmol·g-1）表示，即1 g樣品抗氧化能力相當(dāng)于硫酸亞鐵毫摩爾濃度。測(cè)定反應(yīng)液在波長(zhǎng)592 nm下的吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線求得硫酸亞鐵濃度（μmol·L-1）定義為FRAP值。FRAP值越大，表示抗氧化能力越強(qiáng)。以無(wú)水乙醇為空白組，以BHT為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，通過(guò)GraphPad Prism 7.00軟件作圖。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均以±SE表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性萃取物得率

粗毛纖孔菌甲醇粗提物經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑萃取后，不同極性萃取物得率分別為11.9%、4.5%、24.6%。

2.2 不同極性萃取物總酚含量

粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物的總酚提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物總酚提取率Fig.2 Polyphenol yield of Inonotus hispidus fruiting body extracts

由圖2可知，以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程（R2=0.997 2） 為：

不同極性溶劑對(duì)多酚提取率影響較大，4種萃取物的多酚提取率有顯著性差異（P＜0.001）。乙酸乙酯萃取物多酚提取率最高，可達(dá)（10.21±0.03）%，其次分別為正丁醇萃取物（4.85±0.18）%、甲醇萃取物（1.85±0.04）%、石油醚萃取物（1.07±0.02）%。

2.3 不同極性萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的情況見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用顯著高于其他極性萃取物（P＜0.001），且隨樣品濃度升高，抑制率逐漸上升。1 000 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，為（98.17±0.60）%，其次是正丁醇萃取物（88.60±0.68）%，甲醇萃取物（50.62±1.32）%，石油醚萃取物 （6.12±0.60）%。結(jié)果表明，抑制α-葡萄糖苷酶活性的物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯和正丁醇萃取物中。

圖3 粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的測(cè)定Fig.3 The α-glucosidase inhibition of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.4 不同極性萃取物對(duì)DPPH自由基清除能力的影響

粗毛纖孔菌子實(shí)體4種萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率的清除率見(jiàn)表1。

如表1所示，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基均具有一定清除作用。500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1石油醚萃取物，125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物，DPPH自由基的清除能力與陽(yáng)性對(duì)照BHT相當(dāng)。

表1 粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率Tab.1 DPPH scavenging activity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.5 不同極性萃取物對(duì)ABTS自由基清除能力影響

粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物對(duì)ABTS自由基清除率見(jiàn)表2。

由表2所示，清除率與萃取物濃度呈明顯的效量關(guān)系，乙酸乙酯和正丁醇萃取物均顯示出一定的ABTS自由基清除活性。500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物，1 000 μg·mL-1正丁醇萃取物對(duì)ABTS自由基清除能力與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比，無(wú)顯著性差異。

表2 粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物對(duì)ABTS自由基清除率測(cè)定Tab.2 ABTS free radical scavenging capacity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

2.6 不同極性萃取物對(duì)總抗氧化能力測(cè)定

由FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回歸方程為：Y=0.569 7X+0.049 7，R2=0.999 3。粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物的總抗氧化能力測(cè)定見(jiàn)表3。

由表3可知，4種不同極性萃取物的總抗氧化能力具有明顯的劑量依賴關(guān)系。250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1乙酸乙酯萃取物的 FRAP值，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BHT（P＜0.05）。

表3 粗毛纖孔菌子實(shí)體不同極性萃取物的總抗氧化能力測(cè)定Tab.3 The total antioxidant capacity of Inonotus hispidus fruiting body extracts

3 討論

當(dāng)體內(nèi)積累大量自由基無(wú)法正常代謝時(shí)，會(huì)使人體抗氧化能力下降，同時(shí)引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生肺炎、糖尿病、癌癥等病癥[22]。粗毛纖孔菌作為一種珍貴的藥用真菌，其含有的酚類物質(zhì)可通過(guò)在體內(nèi)調(diào)節(jié)代謝酶活性[23]，體外清除自由基發(fā)揮抗氧化作用[24]。研究結(jié)果表明，在4種不同極性萃取物中，乙酸乙酯萃取物總酚含量最高，是石油醚萃取物的9.54倍、正丁醇萃取物的2.11倍、甲醇萃取物的5.51倍；與同濃度的4種不同極性萃取物相比，乙酸乙酯萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)；清除DPPH、ABTS自由基的能力與陽(yáng)性對(duì)照BHT相比無(wú)顯著性差異，總抗氧化能力顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BHT。正丁醇萃取物的總酚含量、α-葡萄糖苷酶的抑制能力僅次于乙酸乙酯萃取物，說(shuō)明粗毛纖孔菌發(fā)揮抗氧化作用的有效活性物質(zhì)主要存在于乙酸乙酯和正丁醇萃取物中。因此，應(yīng)對(duì)乙酸乙酯、正丁醇萃取物進(jìn)行深層次的藥理活性研究，進(jìn)一步闡明粗毛纖孔菌發(fā)揮降糖、抗氧化作用的機(jī)制及途徑，為深入開(kāi)發(fā)粗毛纖孔菌的藥用價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。