張榮, 魯東平, 王芬, 賈婕 , 張偉蓮 , 楊文志, 李濱燕, 劉婷

1.深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))皮膚科，廣東 深圳 518133；2.深圳市寶安區(qū)慢性病防治院皮膚科，廣東 深圳 518133；3.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院產(chǎn)科，湖北 黃石 435000

梅毒是梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染所引起的一種慢性性傳播疾病，如果未及時(shí)驅(qū)梅治療，晚期可能會(huì)對(duì)全身很多器官、系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害[1]。近年來(lái)，我國(guó)梅毒發(fā)病率增長(zhǎng)迅速，梅毒血清固定發(fā)病率也有明顯上升[2]。已有的研究表明約有35.2%～44.4%的梅毒患者在規(guī)范或未規(guī)范驅(qū)梅治療后發(fā)生梅毒血清固定[3]，在臨床隨訪工作中這種現(xiàn)象比較普遍，其具體形成機(jī)制尚不清楚，讓醫(yī)患都感到很困惑[4]。輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17，Th17)是一種重要的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞，在機(jī)體抵抗細(xì)菌、真菌、螺旋體等病原體感染中發(fā)揮重要作用，并與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。Th17細(xì)胞主要通過(guò)其分泌的白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、白細(xì)胞介素-21(interleukin-21，IL-21)等細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮抗感染的免疫學(xué)效用，目前對(duì)于Th17及這些細(xì)胞因子如何參與Tp的免疫致病過(guò)程，以及它們?cè)诿范狙骞潭ǖ男纬蓹C(jī)制中如何起作用仍不明確。本次研究擬通過(guò)探討梅毒血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性患者IL-17、IL-21水平與TRUST滴度的關(guān)系，期望為梅毒血清固定的成因提供新的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取來(lái)自2017年2月—2018年6月在我院皮膚科就診及長(zhǎng)期隨訪的患者和體檢科的健康者。已確診的梅毒血清固定患者30例作為觀察組，其中男17例，女13例；平均年齡38.42(20～54)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①配偶或患者有不潔性交史； ②在確診為血清固定前已接受過(guò)規(guī)范的驅(qū)梅治療；無(wú)臨床癥狀或治療后臨床癥狀消失；③血清學(xué)甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(tolulized red unheated serum test,TRUST)、梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(treponema pallidum particle agglutination test，TPPA)檢測(cè)均陽(yáng)性，每3～6個(gè)月復(fù)查1次，其中TRUST滴度均≤1 ∶8，在治療后隨訪的3年期間滴度無(wú)上升或下降4倍的情況；④HIV檢測(cè)陰性；⑤無(wú)其它自身免疫性疾病[6]。早期梅毒患者30例為第一對(duì)照組，其中男20例，女10例；平均年齡36.52(22～53)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有多性伴，不安全性行為或性伴感染史；②有一、二期梅毒的癥狀和體征；③非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)和梅毒螺旋體抗原血清學(xué)實(shí)驗(yàn)均陽(yáng)性；④尚未接受驅(qū)梅治療[7]。正規(guī)驅(qū)梅治療后TRUST陰轉(zhuǎn)、TPPA陽(yáng)性者30例為第二對(duì)照組，其中男18例，女12例；平均年齡42.34(22～55)歲。30例健康體檢者為健康對(duì)照組，其中男16例，女14例；平均年齡38.42(23～61)歲；HIV檢測(cè)均為陰性。各組患者年齡(F=4.17，P=0.019)、性別(2=0.66，P=0.721)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 試劑與儀器

TRUST梅毒試劑盒(北京北大未名診斷試劑有限公司)；TPPA梅毒確診試劑盒(北京海富達(dá)科技有限公司)；IL-17、IL-21 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)。水平旋轉(zhuǎn)儀梅毒RPR、TRUST振蕩器(上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司)；Microfuge 20/20R離心機(jī)(美國(guó)貝克曼)。

1.3 檢測(cè)方法

抽取所有受試者5 mL外周靜脈血，離心，取其中部分血清立即做TRUST、TPPA試驗(yàn)，部分血清于-80 ℃凍存?zhèn)溆么郎y(cè)。 TRUST和TPPA檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作和判讀結(jié)果，所有結(jié)果均由兩人單獨(dú)判讀。陰性標(biāo)本要求TRUST試驗(yàn)檢測(cè)至1 ∶32，陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告TRUST滴度，判讀時(shí)不再進(jìn)行強(qiáng)弱分級(jí)。ELISA法檢測(cè)血清中的IL-17、IL-21，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)，組間IL-17、IL-21水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；IL-17、IL-21水平與TRUST滴度相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清IL-17、IL-21 水平比較

早期梅毒組血清IL-17、IL-21含量最高，與健康對(duì)照組、治療后TRUST轉(zhuǎn)陰組、梅毒血清固定組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-17：t值分別為15.21、15.10、19.85，P值均<0.01；IL-21：t值分別為10.04、9.92、12.25,P值均<0.01)；血清固定組血清IL-17、IL-21水平低于健康對(duì)照組和治療后TRUST轉(zhuǎn)陰組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-17:t值分別為5.05、5.30，P值均<0.01；IL-21：t值分別為3.37、3.18，P值均<0.01)；健康對(duì)照組和治療后TRUST轉(zhuǎn)陰組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(IL-17：t=0.18，P=0.854；IL-21:t=0.41,P=0.685)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清IL-17、IL-21水平比較Tab.1 Comparison of serum IL-17, IL-21 levels among the four

2.2 早期梅毒組IL-17、IL-21水平與TRUST滴度相關(guān)性分析

早期梅毒組中TRUST滴度分布情況：9例1 ∶32，11例1 ∶64， 7例1 ∶128， 3例1 ∶256，對(duì)IL-17、IL-21 水平與TRUST滴度值之間的關(guān)系進(jìn)行線性分析，R2值分別為0.723、0.803，Pearson分析相關(guān)系數(shù)分別為0.75、0.62，P值均<0.01，提示早期梅毒組IL-17、IL-21與TRUST滴度之間均正相關(guān)，見(jiàn)圖1。

圖1 早期梅毒組血清IL-17、IL-21水平與TRUST滴度線性關(guān)系

2.3 梅毒血清固定組IL-17、IL-21水平與TRUST滴度相關(guān)性分析

梅毒血清固定組患者中TRUST滴度分布情況： 7例1 ∶1， 12例1 ∶2， 10例1 ∶4， 1例1 ∶8，對(duì)IL-17、IL-21水平與TRUST滴度值之間的關(guān)系進(jìn)行分析，R2值分別為0.060、0.029，Pearson分析相關(guān)系數(shù)分別為0.22、0.15，P值分別為0.122、0.218，提示血清固定組IL-17、IL-21水平與TRUST滴度之間均無(wú)明顯線性相關(guān)性，見(jiàn)圖2。

圖2 梅毒血清固定組血清IL-17、IL-21 水平與TRUST滴度線性關(guān)系

3 討論

機(jī)體感染Tp后會(huì)受刺激產(chǎn)生兩類抗體：抗Tp的特異性抗體和非特異性抗體。其中臨床上常用于療效評(píng)價(jià)的TRUST是非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，檢測(cè)的是非特異性抗體中的抗心磷脂反應(yīng)素。已有大量實(shí)驗(yàn)和臨床觀察表明在早期梅毒患者中，抗心磷脂反應(yīng)素的消長(zhǎng)曲線與早期梅毒的臨床癥狀有較好的相關(guān)性，其滴度的高低往往與梅毒的活動(dòng)性相關(guān)。早期梅毒患者確診后按規(guī)范用青霉素進(jìn)行驅(qū)梅治療，大部分患者臨床癥狀會(huì)完全消失，TRUST滴度會(huì)下降4倍或以上，達(dá)到臨床治愈，但也有相當(dāng)一部分患者治療后TRUST在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)或終生不會(huì)轉(zhuǎn)陰，滴度維持在1 ∶8或以下，即表現(xiàn)為梅毒血清固定現(xiàn)象。

梅毒血清固定的發(fā)生可能受到多種因素影響，例如性別、年齡、治療藥物、治療時(shí)間等，但都尚未有定論，由于Tp無(wú)法體外培養(yǎng)，對(duì)于其病理機(jī)制的研究重點(diǎn)在免疫學(xué)方面。Tp進(jìn)入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，其中以細(xì)胞免疫的作用更為重要。根據(jù)表面標(biāo)志物不同可將分化成熟的T淋巴細(xì)胞劃分為CD4+T和CD8+T兩個(gè)細(xì)胞亞群，CD4+T細(xì)胞主要是Th細(xì)胞，分為Th1和Th2型。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞主要分泌IL-6等細(xì)胞因子參與體液免疫應(yīng)答[8]。當(dāng)前很多學(xué)者認(rèn)為梅毒血清固定的發(fā)生可能與Th1/Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子比例失調(diào)相關(guān)，針對(duì)T淋巴細(xì)胞的研究顯示Th1細(xì)胞早期活化隨著病程遷移而活性降低，Th2免疫應(yīng)答被過(guò)早激活，Th1/Th2降低導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，無(wú)法徹底清除梅毒螺旋體，致感染進(jìn)入慢性階段[9-10]；劉百靈等[11]報(bào)道，梅毒血清固定患者存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的異常，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相關(guān)因子mRNA 水平表達(dá)增多，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能增強(qiáng)，而Th17細(xì)胞功能受到抑制，IL-17等細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，可能會(huì)致使體內(nèi)的Tp不能被徹底清除，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生相關(guān)抗體，導(dǎo)致血清固定現(xiàn)象的形成。

Th17細(xì)胞分泌IL-17、IL-21，在自身免疫性疾病、機(jī)體抗感染過(guò)程中發(fā)揮作用[12-13]， 有研究顯示IL-17、IL-21在支氣管哮喘、胃癌、肝癌等多種疾病患者外周血中呈現(xiàn)高表達(dá)[14]；并且兩者一般具正相關(guān)關(guān)系，二者共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫活動(dòng)[15]。關(guān)楊等[16]研究顯示IL-17及IL-21在梅毒固定患者體內(nèi)的基因表達(dá)下調(diào)，但關(guān)于IL-21與早期梅毒關(guān)系報(bào)道較少。本研究采用雙抗體夾心ELISA法對(duì)早期梅毒患者相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-21進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)早期梅毒患者血清中IL-17、IL-21水平明顯高于三個(gè)對(duì)照組(P值均<0.05)，且健康對(duì)照組與治療后TRUST陰轉(zhuǎn)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明機(jī)體感染Tp后，Tp作為抗原刺激T淋巴細(xì)胞等活化并分泌大量IL-17、IL-21進(jìn)入血液循環(huán)，參與梅毒免疫應(yīng)答。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)早期梅毒患者血清中IL-17、IL-21水平與TRUST滴度正相關(guān)，推測(cè)可能是因?yàn)門RUST滴度高的患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的針對(duì)Tp感染的免疫應(yīng)答，造成了IL-17、IL-21大量分泌。

本研究對(duì)梅毒血清固定、治療后TRUST轉(zhuǎn)陰組和健康對(duì)照組的血清IL-17、IL-21檢測(cè)結(jié)果顯示：血清固定組血清IL-17、IL-21水平低于健康對(duì)照組和治療后轉(zhuǎn)陰組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而健康對(duì)照組與治療后TRUST陰轉(zhuǎn)組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。正常情況下，伴隨著梅毒螺旋體的清除，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能亦逐漸恢復(fù)到正常水平，但梅毒血清固定患者免疫功能存在異常，不能完全清除Tp，推測(cè)可能由于血清固定組患者的Th17細(xì)胞功能受到抑制，導(dǎo)致IL-17、IL-21表達(dá)下調(diào)，但具體的免疫抑制原因尚不清楚。另外，本研究結(jié)果顯示血清固定患者血清TRUST滴度與IL-17、IL-21無(wú)線性關(guān)系，可能一方面由于梅毒血清固定患者免疫功能異常，不能產(chǎn)生足夠的IL-17、IL-21等細(xì)胞因子參與梅毒免疫，另一方面也可能是Tp可以逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)，機(jī)體的免疫功能不能清除病原體，組織內(nèi)仍有少量Tp長(zhǎng)期存在，但不足以激發(fā)免疫反應(yīng)[17]，造成二者無(wú)明顯相關(guān)性。

綜上所述，早期梅毒患者體內(nèi)的IL-17、IL-21參與了梅毒免疫過(guò)程，且與TRUST滴度呈正相關(guān)；梅毒血清固定患者血清中IL-17、IL-21水平降低可能與血清固定的形成相關(guān)，但與TRUST滴度不相關(guān)，這種現(xiàn)象是因?yàn)槊范狙骞潭ɑ颊唧w內(nèi)長(zhǎng)期存在極少量的Tp還是機(jī)體免疫異常引起尚不清楚，具體原因和機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。