岳云飛，韓永魁，張 奎，申曉彧

（山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)院，山西太原030000）

巨噬細胞內膽固醇的代謝紊亂及蓄積量過多會導致其泡沫化，泡沫細胞內有著大量的脂肪，是動脈斑塊形成的一大因素，而巨噬細胞內膽固醇的代謝紊亂及蓄積量過多會導致其泡沫化，對于動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起了重要作用［1，2］。已有資料表明，在巨噬細胞的細胞膜表面，CD36 可以和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）相結合，并在此前提下進一步促進了單核巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎倪^程，是 動 脈 粥 樣 硬 化 形 成 的“ 罪 犯 因 子”之 一［3］。ACAT1 對游離膽固醇具有催化作用，使其轉化為膽固醇酯，因此ACAT1 與CD36 在對膽固醇在細胞內的代謝中同樣起著關鍵性的作用［4］。且都能夠加劇細胞內膽固醇的蓄積，加快動脈粥樣硬化的發(fā)生速率。部分研究發(fā)現，人體內GLP-1 的分泌場所主要來源于小腸中的L 細胞，有2 種生物活性形式，其中之一為GLP-1（7-36a），GLP-1 約80%的活性來自7-36a；另一種活性形式為GLP-1（7-37），其酰胺化產物為GLP-1（7-36a）。有大量研究發(fā)現，GLP-1對人體具有多種益處，在對心血管層面則起著抑制動脈粥樣硬化發(fā)展的作用，但其分子機制及通路尚未完全明確［5，6］。在動物組織學層面已得到證實［7］，GLP-1 類似物能夠減少主動脈根部斑塊面積，從而抑制動脈粥樣的發(fā)展過程，本研究旨在從細胞學角度進一步觀察GLP-1 能否降低ACAT1 與CD36 的表達，并通過檢驗細胞內膽固醇的含量來進一步驗證GLP-1 在人體內能夠通過抑制ACAT1 與CD36的表達，從而減少細胞內膽固醇的蓄積，最終起到延緩動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的具體過程，并為延緩動脈斑塊的形成提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 藥物

GLP-1（7-36）貨號：249125，由上海吉爾生化有限公司生產，GLP-1（7-36）抑制劑［（Exendin（9-39）］貨號：055285，由上海吉爾生化有限公司生產。

1.2 試劑

Raw264.7 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞、辣根過氧化物酶標記二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限公司）；ACAT1 一抗（武漢三鷹生物有限公司）；CD36 一抗（上海拜力生物科技有限公司）；PCR 試劑盒［寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和分組 取小鼠來源的巨噬細胞，并置于37℃、5%CO2條件下進行培育，將其濃度調整為適宜濃度，接種于6 孔培養(yǎng)板，加用RPMI-1640 培養(yǎng)液，饑餓培育1 h 單核細胞，再加入50 mg/L 的ox-LDL 將巨噬細胞誘導為泡沫細胞，而后加入5 nmol/L 的GLP-1（7-36），然后將細胞分為4 組：空白對照組（巨噬細胞）、實驗組（將巨噬細胞誘導成的泡沫細胞）、GLP-1 激動組（在泡沫細胞的基礎上加 入GLP-1）、GLP-1 抑 制 組［GLP-1 及 其 抑 制 劑Exendin（9-39）］。

1.3.2 油紅O 染色 將濃度為50 mg/L 的ox-LDL滴入巨噬細胞對其進行干涉處理24 h，60%異丙醇潤洗，每孔各1 次，各孔內加入1 mL 油紅O 染色15 min，再用蘇木精染色2 min，干預后的細胞泡沫化狀況及形態(tài)用倒置顯微鏡察看。

1.3.3 RT-PCR 檢測細胞中的ACAT1 和CD36 mRNA 表達 按照試劑盒法提取總RNA，進行逆轉錄及PCR 擴增，首先，在94℃下預變性3 min，然后再按照變性、退火的順序進行40 次循環(huán)。ACAT1 上 游 引 物：5'-ACGTAATGAGCAGAG?GAGCAACAC-3'，下 游 引 物：5'-CGTATCCT?GTTCCTGCCGTGAG-3'；CD36 上 游 引 物：5'-CTTTGAAAGAACTCTTGTGGGG-3'，下 游 引物：5'-GTCTGTGCCATTAATCATGTCG-3'；β肌動蛋白（β-actin）上游引物：5'-CGAGCUCAAGC?GAUUUCCUCGUAU-3'，下游引物：5'-AGCTCC?GTCTATGGTGGTGGCTAT-3'；內參為β-actin。

1.3.4 Western blot 法檢測各組細胞中CD36 和ACAT1 蛋白表達 將巨噬細胞誘導轉化成為泡沫細胞并對其進行相應的處理之后，使用裂解液提取細胞內總蛋白，并用BCA 法對提取出的蛋白行定量分析。行凝膠電泳、濃縮電泳和分離電泳，再通過濕轉法完成轉膜，之后用牛奶封閉2～4 h。一抗在溫度為4℃條件下以（1∶1 000）孵育過夜。漂洗3次，二抗（1∶2 000）在室溫下孵育2 h。漂洗3 次，實驗結果用凝膠成像系統(tǒng)進行收集，并測定條帶灰度值，將內參基因設定為β-actin。

1.3.5 高效液相色譜法測定細胞內各膽固醇水平 將各組干預后的細胞，參考膽固醇測定試劑盒說明書，在酶標儀儀器發(fā)射波長為590 nm 處檢測熒光值，游離膽固醇可以直接被檢測出；膽固醇的測量需要在膽固醇酯酶的處理下檢測；膽固醇酯的測量則為膽固醇與游離膽固醇的差值，單位為mg/mL。

1.4 統(tǒng)計學處理

結果采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件處理分析，計量資料均以（±s）來進行表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 油紅O 染色

用ox-LDL 對巨噬細胞行干涉處理后，對其行油紅O 染色，并在鏡下察看結果，其形態(tài)飽滿，在細胞內能夠觀察到大量的脂滴顆粒后，可以確信泡沫細胞（巨噬細胞來源）的模型已成功建立。

2.2 各組CD36 和ACAT1 mRNA 表達比較

與空白對照組比較，實驗組的CD36 和ACAT1 mRNA 表達顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與實驗組比較，GLP-1 激動組CD36 和ACAT1 mRNA 表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與GLP-1 激動組比較，GLP-1 抑制組CD36 和ACAT1 mRNA 表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組ACAT1 和CD36 mRNA 表達比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

表1 各組ACAT1 和CD36 mRNA 表達比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與實驗組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動組比較，▲P＜0.05。

CD36 mRNA 0.49±0.08 1.02±0.26 *0.52±0.08#0.97±0.14▲組別空白對照組實驗組GLP?1 激動組GLP?1 抑制組ACAT1 mRNA 0.53±0.08 1.01±0.17*0.62±0.18 0.92±0.23▲

2.3 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達比較

與空白對照組比較，實驗組CD36 和ACAT1蛋白表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與實驗組比較，GLP-1 激動組CD36 和ACAT1 蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與GLP-1 激 動 組 比 較，GLP-1 抑 制 組CD36 和ACAT1 蛋白表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2 及圖1。

表2 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達比較（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

表2 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達比較（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與實驗組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動組比較，▲P＜0.05。

CD36 蛋白0.55±0.14 1.01±0.21*0.56±0.12#0.99±0.10▲組別空白對照組實驗組GLP?1 激動組GLP?1 抑制組ACAT1 蛋白0.55±0.07 0.98±0.09*0.65±0.15#0.91±0.24▲

圖1 各組CD36 、ACAT1 的蛋白相對表達量比較Fig 1 The relative expression level of CD36 and ACAT1 proteins in each group

2.4 各組膽固醇水平比較

與空白對照組比較，實驗組TC、FC、CE 水平均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與實驗組比較，GLP-1 激動組TC、FC、CE 水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與GLP-1 激動組比較，GLP-1 抑制組TC、TC、CE 水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組膽固醇表達比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

表3 各組膽固醇表達比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與實驗組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動組比較，▲P＜0.05。

CE 6.55±1.01 50.87±0.56*10.36±0.65#35.84±0.78▲組別空白對照組實驗組GLP?1 激動組GLP?1 抑制組TC 20.22±0.99 81.43±0.87*29.21±0.65#59.29±0.84▲FC 13.47±0.02 30.60±0.31*18.99±0.65#23.44±0.06▲

3 討論

細胞中膽固醇代謝主要包括膽固醇的攝取和酯化以及流出等過程［8］，整個過程在正常情況下都會受到嚴格的調控，從而維持巨噬細胞內脂質水平的正常。若是攝取和酯化過程遭到干擾，導致調控能力下降，則可引起巨噬細胞內持續(xù)高膽固醇水平。過高的膽固醇水平會使巨噬細胞朝泡沫細胞進行轉化，致使動脈粥樣硬化的發(fā)展過程進一步加快［9］。在ox-LDL 攝取過程中，當CD36 特異性結合ox-LDL 后，其13-羥基十八碳二烯酸和9-羥基十八碳二烯酸被釋放出，并通過絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B 以及蛋白激酶C 等路徑使氧化物酶增殖活化受體γ 被激活，被激活后的氧化物酶增殖活化受體γ 再進一步與視黃醇受體結合，開始了CD36 mRNA 的轉錄過程，進而使CD36 表達上調，CD36表達上調又進一步增加對ox-LDL 的攝取，且此反應不受負反饋的調節(jié)［10，11］。據相關文獻報道，先天性CD36 缺乏的患者，其發(fā)生動脈粥樣硬化發(fā)生的概率相較正常人而言相對處于較低水平。另有研究發(fā)現［12］，在高脂血癥患者的體內，其外周血中CD36mRNA 的表達量也會遠高于正常人。在膽固醇合成較高會導致細胞內膽固醇大量蓄積，使其代謝失衡，而作為此合成過程的關鍵酶，ACAT1 則能夠 有 效 的 調 節(jié) 細 胞 內 的 膽 固 醇 水 平［13，14］。ACAT1與ACAT2 同屬ACAT 的兩個亞型，前者高表達于巨噬細胞內，而后者則主要表達在小腸中［15］，參與脂蛋白加工過程。有關研究發(fā)現，ACAT1 在巨噬細胞內可以將游離膽固醇合成為膽固醇酯，當血脂較高時，巨噬細胞膽固醇酯會處于高水平狀態(tài)，在此水平下，巨噬細胞泡沫化發(fā)展進程也會逐步加快。

本研究中實驗組中CD36 、ACAT1 mRNA 和蛋白的表達水平及TC、FC、CE 的含量均高于空白對照組，這表明CD36 與ACAT1 在巨噬細胞內表達與泡沫化程度呈正相關。因此是否可以通過藥物作用于CD36、ACAT1 靶點，并降低其表達，從而減少巨噬細胞內膽固醇含量，并起到抑制巨噬細胞泡沫化成為本實驗的主要研究目的。在本實驗中，GLP-1 激 動 組 中CD36 、ACAT1 mRNA 和 蛋 白 的表達水平及其胞內的TC、FC、CE 的含量要低于實驗組，進一步證明GLP-1 可通過下調ACAT1、CD36 表達來降低細胞內膽固醇水平。尤其是對于患有2 型糖尿病的動脈粥樣硬化癥患者，可以更好的降低心血管病風險［16，17］。有研究證實［18］，GLP-1類似物與其受體相結合后，可以起到增強胰島素分泌、降低胰島素抵抗等降糖作用，亦可使冠心病病人從中獲益。此外，GLP-1 激動劑還能夠起到獨立于降糖作用以外的抗動脈粥樣硬化作用［19］，減少冠脈的斑塊面積。一項Mate 分析表明，GLP-1 受體激動劑還能夠降低缺血性腦卒中的發(fā)生風險［20］。

綜上所述，GLP-1 對于人體多個系統(tǒng)均有益處，本研究在冠脈粥樣硬化方面發(fā)現，GLP-1 受體激動劑可以減少巨噬細胞內CD36、ACAT1 mRNA和蛋白得表達水平，減少膽固醇的攝取及合成，從而減少巨噬細胞內膽固醇蓄積，并阻止其泡沫化，達到抑制動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的目的，降低心血管疾病風險。所以，應用GLP-1 類似藥物來針對CD36、ACAT1 這兩個靶點對動脈粥樣硬化進行預防具有重要意義。