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        動(dòng)物血清中四環(huán)素類殘留的快速檢測(cè)
        ——放射免疫法

        2021-04-08 02:21:08蘇明明張曉聲沈偉健
        中獸醫(yī)學(xué)雜志 2021年10期
        關(guān)鍵詞:金霉素試管控制點(diǎn)

        王 楠,蘇明明,張曉聲,沈偉健,陳 靜

        (大連海關(guān)技術(shù)中心,遼寧大連 116000)

        四環(huán)素是四環(huán)素族抗生素中最基本的化合物,分子式為C22H24N2O8,本身及其鹽類都是黃色或淡黃色的晶體,在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定性極高,除金霉素外,其他的四環(huán)素族的水溶液都相當(dāng)穩(wěn)定。四環(huán)素族除可溶于低濃度的酸堿溶液,也可以微溶于水、甲醇、乙醇等溶液,但不溶于醚類溶液,如石油醚等[1~2]。四環(huán)素族抗生素主要包括金霉素、土霉素、四環(huán)素。四環(huán)素類抗生素在20 世紀(jì)中葉時(shí)期被科學(xué)家發(fā)現(xiàn),屬于廣譜抗生素,廣泛應(yīng)用于革蘭氏細(xì)菌和細(xì)胞支原體引起的細(xì)菌感染[3~5]。目前,四環(huán)素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在畜牧業(yè)發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,并且可以預(yù)防和治療動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的多種感染性疾病[6~7]。然而,在動(dòng)物屠宰之前,動(dòng)物體內(nèi)的四環(huán)素不能完全代謝掉,有很大一部分殘留下來(lái),并主要集中在肝臟和腎臟部位[8~10]。人們?cè)谑秤昧擞兴沫h(huán)素類抗生素殘留的動(dòng)物源食品,會(huì)對(duì)身體造成嚴(yán)重的傷害,引起較多嚴(yán)重疾病,比如肝腎中毒,影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及血液系統(tǒng)的疾病等。如果長(zhǎng)期食用,不僅會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株,還會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),降低對(duì)病菌的免疫能力[11]。我國(guó)2020年4月實(shí)施的GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》以及一些歐美等國(guó)家,都對(duì)食品中四環(huán)素類藥物殘留量做了嚴(yán)格的規(guī)定:土霉素、四環(huán)素、金霉素最低值都不得超過(guò)100 μg/kg。

        目前,四環(huán)素類藥物檢測(cè)方法有許多種,主要有微生物檢測(cè)法、高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。其中,微生物檢測(cè)法耗時(shí)較長(zhǎng),且容易被其他抗生素類干擾,檢測(cè)準(zhǔn)確度不足。高效液相色譜法是目前常用的可以對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)的方法,檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度較高,但是前處理方法復(fù)雜費(fèi)時(shí),且成本較高,不適合快速檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法容易產(chǎn)生交互反應(yīng),且需要對(duì)每一種抗體進(jìn)行分別標(biāo)記,導(dǎo)致檢測(cè)費(fèi)用較高,且無(wú)法解決同時(shí)檢測(cè)四環(huán)素類藥物多殘留的問(wèn)題[12~13]。Charm Ⅱ放射免疫分析法具有樣品前處理簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),可以檢測(cè)四環(huán)素類藥物殘留總量,并且具有高效液相色譜法檢測(cè)的準(zhǔn)確性和免疫吸附法檢測(cè)的高效性,適用于初篩檢測(cè)。該檢測(cè)方法也已經(jīng)得到了美國(guó)FDA和歐盟等國(guó)家的認(rèn)可和應(yīng)用,具有廣闊的應(yīng)用前景。

        1 材料和方法

        1.1 設(shè)備和材料

        Charm Ⅱ7600 分析儀(美國(guó)Charm 公司);高速冷凍離心機(jī);渦旋震蕩器;恒溫培養(yǎng)箱(80±2℃);閃爍液加液器;離心管;硼硅玻璃試管及試管塞;液體閃爍計(jì)數(shù)器(美國(guó)Charm 公司);藥片壓桿。

        1.2 樣品和試劑

        檢測(cè)基質(zhì)為羊和雞的血清:分別采集兩種動(dòng)物血液,將采集好的血液置于容器內(nèi),室溫下靜置10 h,等待其析出血清,并收集血清備用。檢測(cè)試劑為四環(huán)素類Charm Ⅱ檢測(cè)試劑盒、閃爍液、陰性對(duì)照液、多抗標(biāo)準(zhǔn)品等

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

        微生物細(xì)胞表面存在著不同的特異性點(diǎn)位,并能夠與各種四環(huán)素類藥物共有功能基團(tuán)相結(jié)合發(fā)生相應(yīng)的微生物受體反應(yīng)。檢測(cè)四環(huán)素類藥物殘留時(shí),同時(shí)加入微生物受體結(jié)合物和[3H]標(biāo)記過(guò)的金霉素。如果樣品中存在四環(huán)素類藥物殘留,就會(huì)同[3H]標(biāo)記過(guò)的金霉素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合微生物受體結(jié)合物的相關(guān)點(diǎn)位。用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定樣品反應(yīng)后的[3H]含量的cpm 值(即每分鐘脈沖數(shù)),cpm 值越低,則四環(huán)素類藥物殘留量越高。

        1.3.2 樣品制備

        在50 ml 離心管中加入1 ml 血液樣品和30 ml MSU 提取緩沖溶液,渦旋振蕩5 min。將離心管于(80±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中放置45 min,取出后置于冷水中10 min,1750 g 離心10 min,取上清液備用。恢復(fù)室溫后,測(cè)定其pH 值是否為7.5,如不準(zhǔn)確則使用試劑盒配置的M2 緩沖液或1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為7.5,即為樣品測(cè)試液。

        1.3.3 測(cè)定步驟

        用藥片壓桿的平端將白色藥片壓入已加入300 μl 蒸餾水的玻璃試管內(nèi),渦旋振蕩10 s 直至藥片破碎。吸取4 ml 處理好的血液試樣放入試管中,壓入橙色藥片,用振蕩器上振蕩15 s,使樣品上下15 次,置于(65±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中3 min,取出后1750 g 離心5 min,離心停止后立即取出試管,倒掉上清液(此時(shí)不宜太用力,防止將有四環(huán)素標(biāo)記的藥物甩出,造成結(jié)果不準(zhǔn)確),用棉簽清理試管壁內(nèi)的殘漬,注意不可觸碰沉淀物。向試管中加入300 μl 蒸餾水,搖動(dòng)試管直至沉淀物完全破碎,之后加入3 ml 閃爍液,渦旋混勻至試管無(wú)不均一的云狀物,放置1 min 后,將試管放入Charm Ⅱ7600 分析儀中,讀取[3H]的cpm 值。

        1.3.4 控制點(diǎn)的建立

        選取六份已知不含四環(huán)素類藥物殘留的血清樣品,按照試劑盒使用說(shuō)明書的要求加入不同濃度的抗生素,按照上述測(cè)定步驟進(jìn)行測(cè)定,得到6 次計(jì)數(shù)值,計(jì)算平均值,則可計(jì)算出控制點(diǎn)為:平均值×(1+20%)。

        1.3.5 結(jié)果判定

        當(dāng)樣品計(jì)數(shù)值大于控制點(diǎn)時(shí),則判定為陰性樣品。當(dāng)樣品計(jì)數(shù)值小于等于控制點(diǎn)時(shí),在初篩時(shí)判定為疑似陽(yáng)性,此時(shí)應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)檢,同時(shí)增加一個(gè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照,判斷使用的檢測(cè)試劑是否失效,以及檢測(cè)的儀器是否出現(xiàn)問(wèn)題。判定樣品為陽(yáng)性有兩個(gè)要求:一是陰性對(duì)照的范圍內(nèi)波動(dòng)不可以超過(guò)陰性對(duì)照平均值的80%~120%;二是陽(yáng)性對(duì)照的計(jì)數(shù)值必須要小于控制點(diǎn)。如果可以同時(shí)滿足以上兩點(diǎn),并且重新測(cè)試的樣品計(jì)數(shù)值也小于控制點(diǎn),則可以判定為陽(yáng)性樣品。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 抗原抗體的競(jìng)爭(zhēng)性

        在Charm Ⅱ放射免疫分析中的受體和[3H]標(biāo)記的金霉素抗原的量是固定的,因此可以通過(guò)對(duì)不同藥物濃度檢測(cè)來(lái)確定方法的靈敏度。以MSU 萃取緩沖液為零標(biāo)準(zhǔn),將MSU 多種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品依次配制成10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0 μg/kg 標(biāo)準(zhǔn)溶液,并分別測(cè)定cpm 值,表1結(jié)果顯示,測(cè)定的cpm 值與添加的藥物濃度呈反比,當(dāng)?shù)竭_(dá)一定濃度后cpm 值將不再變化。

        表1 不同藥物濃度測(cè)定結(jié)果

        2.2 檢出限以及線性范圍的確定

        在已知陰性的基質(zhì)中添加不同濃度的MSU 多種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)試,以確定基質(zhì)的檢測(cè)限。分別向羊血清和雞血清中添加濃度分別為0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/kg 的四環(huán)素測(cè)試,得到結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 不同基質(zhì)中不同添加水平的測(cè)定結(jié)果

        以添加水平的自然對(duì)數(shù)ln(ρ)為自變量,分別對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度的羊血清和雞血清的cpm 數(shù)值相對(duì)值(即相應(yīng)濃度cpm 值與陰性控制cpm 值的比值,B/B0)進(jìn)行線性擬合,得到結(jié)果見(jiàn)圖1~2。

        圖1 羊血清ln(ρ)與B/B0 值擬合曲線

        圖2 雞血清ln(ρ)與B/B0 值擬合曲線

        各數(shù)據(jù)點(diǎn)都較好地分布在擬合曲線兩側(cè),擬合情況良好,各種基質(zhì)中l(wèi)n(ρ)均與cpm 值存在著良好的線性關(guān)系。根據(jù)實(shí)際情況確定檢測(cè)限時(shí),考慮到分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,一般要測(cè)定兩項(xiàng)內(nèi)容,分別是樣品空白加標(biāo)與空白樣品,測(cè)定的cpm 值相對(duì)值應(yīng)該小于0.6,確定金霉素在動(dòng)物血清中的最低濃度應(yīng)不小于20 μg/kg。

        3 結(jié)論

        Charm Ⅱ檢測(cè)方法不僅符合國(guó)內(nèi)四環(huán)素快速檢測(cè)要求,同時(shí)也是其他國(guó)家采用的快速檢測(cè)手段,符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。使用Charm Ⅱ放射免疫分析法檢測(cè)動(dòng)物血清中四環(huán)素類藥物殘留,可以提高檢測(cè)效率,降低檢測(cè)成本,適用于對(duì)大量活體動(dòng)物體內(nèi)四環(huán)素檢測(cè)的陽(yáng)性初篩,具有檢測(cè)靈敏度高、穩(wěn)定性良好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),是一種快速有效的檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)四環(huán)素類藥物殘留的篩選方法。

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